多菌靈降解菌株djl-10的分離及降解特性

袁巧云 孫悅 張跡

摘要：從多菌靈生產廢水處理系統中，通過富集和選擇性培養，分離得到1株能高效降解多菌靈的細菌，并將其命名為djl-10。根據菌株的菌落形態，生理生化特性及基于16S rDNA序列的系統發育分析等，初步將菌株鑒定為分枝桿菌屬。該菌株能利用多菌靈作為唯一碳源、氮源進行生長并基本徹底礦化多菌靈。2-氨基苯并咪唑和2-羥基苯并咪唑為菌株降解多菌靈的中間代謝產物。菌株能夠在較寬溫度和pH值范圍內有效降解多菌靈，其降解多菌靈的最適溫度和pH值分別為37 ℃、7.0。裝液量試驗結果表明，菌株djl-10對多菌靈的降解明顯依賴氧氣。Ca2+、Mg2+、Fe3+等離子能夠明顯促進菌株djl-10對多菌靈的降解。此外，本研究克隆和表達菌株djl-10的多菌靈水解酶基因mhe。酶促反應結果表明，純化的重組酶Mhe對多菌靈具有明顯的催化活性。

關鍵詞：分枝桿菌;多菌靈;生物降解;廢水處理系統

中圖分類號：X172 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0284-05

多菌靈是一種廣譜、內吸性殺菌劑，廣泛應用于防控各種農作物的真菌病害[1]。許多苯并咪唑類和托布津類殺菌劑均可在作物體內轉化為多菌靈而起作用[2]。多菌靈同時還是一種持久性環境污染物，其半衰期在表層土壤中約為3～15周[3-4]。值得注意的是多菌靈在土壤和水體中長期殘留會進一步污染食品，危害人們身體健康[5-6]。研究表明，多菌靈對動物的肝臟和內分泌系統有害，是一種“三致”物質，既使在較低濃度下也會對生物體造成傷害[7-8]。我國每年多菌靈的生產量已超過10 000 t[9]。經生產和使用途徑多菌靈進入環境中，并在土壤、河流中殘留，對各種生物的生長繁殖以及人們的食品安全和身體健康造成潛在的危害。目前，已經報道多種多菌靈降解菌株[7-12]。本研究分離得到1株能高效降解多菌靈的分枝桿菌菌株，并對其降解特性進行初步研究，以期進一步豐富高效多菌靈降解菌株的資源庫。

1 材料與方法

1.1 化學試劑與培養基

多菌靈（純度>98.0%），由江蘇新沂農藥廠贈送;用于高效液相色譜分析的色譜純甲醇，購自江蘇漢邦科技股份有限公司。其他化學試劑均為普通國產分析純試劑。

基礎鹽（MSM）培養基配方：1.0 g/L NaCl，1.0 g/L NH4NO3，1.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，1 000 mL 去離子水;富集分離培養基：在基礎鹽培養基中添加0.01%的多菌靈原藥作為唯一碳氮源;LB培養基配方：10.0 g/L 胰蛋白胨，5.0 g/L酵母粉，5.0 g/L NaCl，1 000 mL 去離子水。

1.2 菌株的富集與分離

取多菌靈生產廢水處理系統中的5 mL活性污泥加入到100 mL富集培養基中，在30 ℃，180 r/min條件下振蕩培養。每隔4 d取5 mL富集培養物接種至100 mL新鮮富集培養基中。經連續3代富集后，取富集液梯度稀釋涂布到含過飽和多菌靈的基礎鹽瓊脂平板上，30 ℃培養3 d。周圍有透明圈的菌落即為疑似多菌靈降解菌，將這些菌株用固體LB培養基平板劃線分離，純化后進一步驗證其多菌靈降解能力。

1.3 菌株鑒定

采用高鹽法提取菌株基因組DNA作為模板，以細菌16S rDNA通用引物PCR擴增菌株16S rDNA序列。PCR擴增產物TA克隆后，轉化大腸桿菌 DH5α菌株感受態細胞，挑選陽性轉化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序序列提交到NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）上進行在線分析，利用Blast軟件在GenBank中與其他菌株16S rDNA序列進行同源性比對。采用軟件Mega 6.0，通過鄰結法構建系統進化樹。菌株djl-10 16S rDNA序列的GenBank登錄號為KX509812。

1.4 多菌靈降解及檢測

1.4.1 菌懸液制備 接種菌株dj1-10至液體LB培養基中，在30 ℃，180 r/min條件下振蕩培養3 d，離心收集菌體，用MSM培養基洗滌并重懸菌體至D600 nm≈1.0。

1.4.2 降解體系構建 以1%的接種量，接種菌懸液至MSM液體培養基中，并添加終濃度為100 mg/L的多菌靈作為唯一碳源和能源。當以多菌靈為唯一氮源時，向降解體系中添加100 mg/L葡萄糖。所有處理均設置3次重復，在30 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養，按特定時間間隔取樣待測。

1.4.3 樣品處理 向待測樣品中加入等體積二氯甲烷，劇烈振蕩2 min，靜置分層后吸出水相，有機相在通風櫥中充分揮發后加甲醇重新溶解定容，用0.22 μm一次性有機相過濾器過濾后進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）分析。

1.4.4 樣品檢測 樣品中多菌靈殘留濃度采用HPLC法檢測，色譜條件為Agilent 1260高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18反向柱（4.6 mm×25.0 cm），流動相為甲醇與0.02 mol/L醋酸銨體積比為65 ∶ 35，流速為1 mL/min，檢測波長為 286 nm，室溫檢測。

1.5 環境條件對菌株降解多菌靈的影響

1.5.1 溫度的影響 將降解體系分別置于20、25、30、37、40、45 ℃條件下振蕩培養24 h，取樣測定不同溫度下菌株 djl-10對多菌靈的降解率。

1.5.2 初始pH值的影響 根據“1.5.1節”中試驗選擇溫度為 37 ℃。分別用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液將MSM培養基的初始pH值調為5、6、7、8、9后構建“1.4.2節”中的降解體系。在37 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養24 h，取樣測定不同pH值條件下菌株djl-10對多菌靈的降解率。

1.5.3 裝液量的影響 在100 mL三角瓶中構建降解體系，并設置10、20、30、40、50 mL等5個裝液量處理組。在37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養24 h，取樣測定不同裝液量條件下菌株djl-10對多菌靈的降解率。

1.5.4 不同金屬離子的影響 分別向多菌靈降解體系中添加MgCl2、CuSO4、CaCl2、MnSO4、ZnSO4、FeCl3、CoCl2等溶液，設置0.1、1.0、 10.0 mmol/L等3個處理濃度。在37 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養24 h，取樣測定不同金屬離子處理條件下菌株djl-10對多菌靈的降解率。以不加金屬離子的多菌靈降解體系為對照。

1.6 多菌靈水解酶基因mhe的克隆與表達

1.6.1 mhe基因的PCR擴增與序列分析 參照文獻[8]設計合成多菌靈水解酶基因的PCR引物MheI-F和MheI-R。以菌株基因組DNA為模板，PCR擴增菌株mhe基因片段。PCR產物TA克隆后，挑選陽性轉化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序序列提交GenBank進行Blast同源性比對分析。

1.6.2 重組表達載體構建 通過引物設計，在mhe基因片段PCR產物的上下游分別引入限制性酶切位點Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ，并通過載體構建的方式將mhe基因片段連接到表達載體pET29a的相應位點上，構建成重組表達載體pET29a-mhe，隨后轉化大腸桿菌BL21（DE3）菌株。

1.6.3 蛋白Mhe誘導表達及純化 在含50 mg/L卡那抗生素的LB液體培養基中，將重組表達菌株于37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養至菌體濃度達到D600 nm≈0.5時，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，簡稱IPTG），在18 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養24 h，以誘導蛋白Mhe表達。采用Ni柱親和層析策略，參照產品說明步驟純化目標蛋白Mhe。純化的目標蛋白透析脫鹽后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.6.4 Mhe酶活力檢測 構建酶促反應體系：500 μL 20 mmol/L Tris-HCl （pH值為8.0），25 μL Mhe酶液，5 μL多菌靈母液（終濃度為10 mg/L），37 ℃恒溫水浴。平行操作15個反應體系，分為5組，每組3次重復，分別在0、2、4、6、8 h 取樣，加入等體積的二氯甲烷終止酶促反應并萃取體系中殘留的多菌靈，用HPLC檢測分析各組樣品中多菌靈的殘留濃度。

2 結果與分析

2.1 多菌靈降解菌株的富集與分離

從處理多菌靈生產廢水的活性污泥中分離得到1株高效多菌靈降解菌株，命名為djl-10。菌株革蘭氏染色為陽性，在LB固體平板上經30 ℃，2～3 d培養后形成黃色菌落。菌株能在以過飽和多菌靈為唯一碳氮源的渾濁基礎鹽瓊脂平板上生長，并在菌落周圍和下方形成清晰的透明水解圈（圖1）。

2.2 菌株djl-10的鑒定

菌株djl-10的16S rDNA序列同源性比對分析顯示其與分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.）菌株有較高的同源性，達99%。分枝桿菌屬與諾卡氏菌屬、紅球菌屬等在親緣關系上相近，同時為考察菌株djl-10與其他已報道的多菌靈降解菌株之間的進化關系，從GenBank中調取它們的16S rDNA序列進行聚類分析，構建系統發育樹。結果表明，其與Mycobacterium sp.親緣關系最近（圖2）。據此，將菌株djl-10初步鑒定為分枝桿菌屬菌株。

2.3 菌株對多菌靈的降解及代謝產物鑒定

菌株djl-10對多菌靈的降解及生長情況如圖3所示，菌株能夠以多菌靈為唯一碳氮源生長，并降解多菌靈。當以多菌靈為唯一氮源時菌株的生長和降解均相對較好，菌株能在24 h內將100 mg/L的多菌靈幾乎徹底降解。而以多菌靈為唯一碳源或唯一碳氮源時，菌株需要近36 h才能將多菌靈基本徹底降解。以多菌靈為唯一氮源時，體系中添加了葡萄糖，能夠促進菌體的快速增加和對多菌靈的降解。因此，葡萄糖的存在應是以多菌靈為唯一氮源時菌株生長和降解更快的原因。

根據文獻[7-8]報道，2-氨基苯并咪唑（2-AB）和 2-羥基苯并咪唑（2-HB）是多種微生物菌株降解多菌靈的中間代謝產物。在菌株djl-10降解多菌的過程中，通過HPLC分析也檢測到了2個中間代謝產物。由圖4可知，這2個代謝產物分別與2-AB、2-HB標準品有相同的保留時間，基于此并結合文獻報道，將這2個代謝產物初步鑒定為 2-AB 和2-HB，這也說明菌株djl-10降解多菌靈的代謝途徑與文獻[7-8]報道的多菌靈降解菌株基本相同。

2.4 環境條件對菌株djl-10降解多菌靈的影響

2.4.1 溫度和初始pH值對降解率的影響 由圖5可知，在溫度低于37 ℃時，多菌靈降解率隨著溫度升高而升高，但當溫度高于37 ℃時，降解率隨著溫度升高略有下降。因此，菌株 djl-10降解多菌靈的最適溫度為37 ℃。由圖6可知，菌株djl-10降解多菌靈的最適pH值為7.0，培養基初始pH值偏酸和偏堿均會抑制多菌靈的降解。

2.4.2 裝液量對降解率的影響 由圖7可知，在100 mL三角瓶中裝液量為10、20 mL時多菌靈的降解率明顯高于裝液量為30、40、50 mL時，且隨著裝液量的增加，降解率逐漸下降，表明菌株djl-10降解多菌靈對氧氣有明顯的需求。

2.4.3 金屬離子對降解率的影響 由圖8可知，Mg2+和Ca2+能夠明顯促進菌株djl-10對多菌靈的降解;Mn2+、Zn2+、Co2+在試驗濃度為0.1、1.0 mmol/L時對降解有明顯促進作用，但濃度為10.0 mmol/L時對降解作用強烈抑制;Cu2+對降解有明顯的抑制作用;值得注意的是，Fe3+在低濃度（01、1.0 mmol/L）時對菌株降解多菌靈的影響不大，但在試驗濃度為10.0 mmol/L時對多菌靈的降解有強烈的促進作用。

2.5 菌株多菌靈水解酶mhe基因的克隆和表達

從菌株dj1-10的基因組DNA中，PCR擴增得到1個特異條帶，測序分析表明其為長度為729 bp，起始密碼子為ATG終止密碼子為TGA，編碼242個氨基酸殘基的開放式閱讀框（ORF）。序列同源性比對分析表明其與已報道的菌株R. erythropolis dj1-11[13]和Nocardioides sp. SG-4G[8]中的多菌靈水解酶基因mhe/mheI的序列相似性分別達到100%、99%。據此，推測該ORF就是菌株djl-10中負責編碼多菌靈水解酶Mhe的基因。

利用大腸桿菌表達系統表達并純化菌株djl-10的多菌靈水解酶Mhe，SDS-PAGE分析結果（圖9）顯示，純化的Mhe為單一條帶，分子量約為26 ku，與基于氨基酸序列推測的理論值（26 251.93 u）相符。酶促反應試驗顯示純化的

Mhe對多菌靈具有催化活性，如圖10所示，在Mhe的催化下，反應體系中多菌靈的殘留濃度隨時間推移逐步降低。這進一步說明該ORF是菌株djl-10中負責編碼多菌靈水解酶的mhe基因。

3 結論

從多菌靈廢水處理系統活性污泥中分離得到1株高效多菌靈降解菌株djl-10，初步鑒定為分枝桿菌屬菌株。該菌株能以多菌靈為唯一碳源、氮源和唯一碳氮源生長并基本徹底降解多菌靈。進一步豐富了多菌靈降解菌株的資源庫。

菌株djl-10降解多菌靈的最適溫度和初始pH值分別為37 ℃、7.0。裝液量試驗結果表明，菌株降解多菌靈時須要好氧環境。Mg2+和Ca2+等多種金屬離子對菌株降解多菌靈有明顯促進作用;Cu2+對降解有明顯的抑制作用;高濃度（10.0 mmol/L）的Fe3+對降解有強烈的促進作用。

2-AB和2-HB是菌株djl-10降解多菌靈的中間代謝產物。菌株中負責催化多菌靈降解的第一步反應的編碼基因是多菌靈水解酯酶基因mhe，該基因表達的產物對多菌靈有明顯的催化活性。

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收稿日期：2018-09-03

基金項目：國家自然科學基金（編號：31300099）。

作者簡介：袁巧云（1981—），女，江蘇鹽城人，碩士，主要從事微生物學研究。E-mail：qiaoyunyuan@163.com。

通信作者：張 跡，博士，講師，主要從事環境微生物學研究。E-mail：zhangjihnu@163.com。