非小細胞肺癌奧希替尼獲得性耐藥細胞株的建立及耐藥后化療敏感性

杜豆 周娟 邱英 馬灝川 紀佳朋 張為民

1廣州中醫藥大學研究生院（廣州510006）；2廣州軍區廣州總醫院腫瘤科（廣州510010）

肺癌是我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤［1］，其中非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）約占80%［2］。在我國，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變型占非小細胞肺癌約30%［3-4］。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）已經成為EGFR 突變陽性的晚期非小細胞肺癌首選治療方案［5］，但是大部分患者在經過第一代EGFR-TKIs 治療10 ～12 個月后出現獲得性耐藥，EGFR 二次突變是獲得性耐藥的主要機制之一［6-8］。針對T790M 突變的第三代EGFR-TKIs 奧希替尼已被用于臨床，并取得了良好的療效。然而使用奧希替尼約在10 個月后仍無法避免地出現了獲得性耐藥，最終導致腫瘤進展［9-10］。目前，對于第三代EGFR-TKIs 耐藥后NSCLC 治療仍無合適的方案，化療仍是耐藥后NSCLC 的主要選擇，如何選擇最有效的化療藥物是臨床面臨的主要問題之一，遺憾的是目前缺乏基礎和臨床研究。本研究選用NSCLC 吉非替尼獲得性耐藥細胞株PC-9∕ZD，予以逐步遞增奧希替尼劑量法建立奧希替尼獲得性耐藥細胞株PC-9∕ZDOR，觀察其生物學特性和檢測其耐藥機制，并探討奧希替尼耐藥后對第三代肺癌化療藥物的敏感性，為研究奧西替尼耐藥機制提供了可靠的細胞模型，也為研究耐藥后NSCLC 選擇合適的化療藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 非小細胞肺癌PC-9∕ZD 細胞為吉非替尼獲得性耐藥細胞株由日本國立癌癥中心小泉史明博士惠贈，CCK-8 試劑購自日本同仁公司；RPMI-1640 培養基、北美血清購于美國Gibco 公司；二甲基亞砜購于MP 公司；EGFR、p-EGFR、Ecadherin、Vimentin、N-Cadherin 抗體購自美國CST公司，GAPDH 購自美國Affinity 公司，免疫印跡化學發光試劑ECL 購自美國Millipore 公司；奧希替尼購自美國SELLECK 公司；多西他賽、吉西他濱、培美曲塞、紫杉醇、順鉑、司美替尼購自MCE公司。

1.2 細胞培養 PC-9∕ZD 細胞培養于37 ℃、5%CO2條件下用含10%北美胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的RPMI-1640 培養液培養，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，實驗時收集生長狀態良好的對數生長期細胞進行實驗。

1.3 耐藥細胞株的建立 通過逐步增加藥物濃度的方法誘導非小細胞肺癌細胞株PC-9∕ZD，取5 ×105個對數期的細胞于培養瓶中，貼壁24 h 后，予以0.1 μmol∕L 奧希替尼為初始濃度作用細胞，每日更換含藥培養基，初始可見細胞大量死亡，待3 ～4 周后細胞逐漸出現耐受穩定生長后，予以普通培養基固定3 ～5 d 后傳代，再次倍增濃度直至循環6 個濃度周期，終止藥物濃度為3.2 μmol∕L，并在終濃度下維持1 個月后更換為無藥培養基繼續培養1 個月，共歷時7 個月，完成整個培養過程，建立的耐藥細胞株被命名為PC-9∕ZDOR。于導置顯微鏡下對比觀察親本細胞株與耐藥細胞株的形態。

1.4 細胞EGFR 基因突變檢測 細胞消化離心后，棄上清液，加入1 mL PBS 吹打均勻，置于4 ℃冰盒中送廣州燃石醫學檢驗中心行NGS 技術檢測肺癌168 基因情況。

1.5 CCK-8 法檢測細胞的耐藥性 取對數生長期PC-9∕ZD 或PC-9∕ZDOR 單細胞懸液接種于96 孔板，3× 103個∕孔；培養24 h 后，加入含相應濃度藥物的培養液200 μL∕孔，每個藥物濃度設5 個復孔，同時設空白組和無藥對照組；繼續培養72 h，仔細吸棄各孔培養液，每孔加入RPMI1640 培養基100 μL 和CCK-8 試劑10 μL，繼續培養1 h；在酶聯免疫檢測儀上于450 nm 波長下檢測各孔的吸光度值，采用Graphpad Prism 6.0 軟件計算各組細胞的半數抑制濃度，再按此公式計算耐藥指數（RI）。RI=IC50（PC-9∕ZDOR）∕IC50（PC-9∕ZD）。

1.6 細胞生長曲線的繪制和倍增時間計算 取對數生長期的細胞PC-9∕ZD、PC-9∕ZDOR 細胞分別接種96 孔板，1 × 103∕孔，每種細胞設5 個復孔，孵育1、2、3、4、5、6 和7 d 后進行細胞增殖檢測，Graphpad Prism 6.0 繪制細胞生長曲線，計算細胞倍增時間。

1.7 Western blot 分析細胞中EGFR 及相關蛋白表達 細胞中加入蛋白裂解液、置于冰上裂解后提取蛋白，并用BCA 法測定蛋白濃度，等量上樣后行8%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉膜，封閉，加入相應的一抗4 ℃孵育過夜，用TBST 搖床洗膜3 次，選擇相應的二抗室溫搖床反應1 h，再用TBST 洗膜3 次，最后用ECL 顯色并采用化學發光成像系統成像。

1.8 統計學方法 采用Graphpad Prism 6.0 統計軟件進行分析數據和作圖，數據結果用表示。采用t檢驗比較兩組間數據，單因素方差分析比較多組間數據，P＜0.05 為差異有統計學意義。以上實驗數據均重復3 次。

2 結果

2.1 PC-9/ZDOR 耐藥細胞株的建立 歷時7 個月成功將PC-9∕ZD 細胞體外誘導成奧希替尼獲得性耐藥細胞株，命名為PC-9∕ZDOR。洗脫奧希替尼后6 個月，CCK-8 法檢測親本細胞及耐藥細胞株對奧希替尼的IC50值，結果顯示較親本細胞PC-9∕ZD，耐藥細胞株PC-9∕ZDOR 對奧希替尼的敏感性顯著下降，IC50值分別為（0.08 ± 0.15）和（3.52 ± 0.03）μmol∕L（P＜0.05），RI 為44（圖1）。

2.2 耐藥細胞株的EGFR 基因變化 采用NGS 技術檢測PC-9∕ZD 細胞結果顯示為EGFR p.E746_A750del伴隨T790M及EGFR amp，耐藥細胞株PC-9∕ZDOR 結果顯示EGFR p.E746_A750del 及T790M 均消失，無其他EGFR 基因表達也無EGFR 擴增。

圖1 PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR 的奧希替尼藥物濃度-細胞存活率曲線Fig.1 The cell viability of osimertinib in PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cells

2.3 細胞生長曲線及腫瘤倍增時間 細胞生長曲線顯示，兩種細胞增殖無明顯差異。PC-9∕ZD 細胞倍增時間為（35.44 ± 0.77）h，PC-9∕ZDOR 細胞倍增時間為（37.99±2.14）h（P＞0.05，圖2）。

圖2 PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR 細胞的生長曲線Fig.2 The proliferation ability of PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cells

2.4 細胞形態學變化 在倒置顯微鏡下PC-9∕ZD、PC-9∕ZDOR 細胞均為貼壁生長。PC-9∕ZD 細胞呈長梭形和圓形為主，長偽足，排列無規則。而PC-9∕ZDOR 細胞相互鑲嵌，呈團簇樣生長，細胞較為扁平，體積稍變小變圓（圖3）。

2.5 耐藥細胞株EMT 標志蛋白、EGFR、p-ERK及p-AKT 蛋白表達變化 與親本細胞比較，耐藥細胞株PC-9∕ZDOR 細胞的EGFR 及其磷酸化蛋白表達顯著減少（P＜0.05），E-Cadherin 和N-Cadherin的蛋白表達量明顯減少（P＜0.05），間質標志Vimentin 的蛋白表達量未見增加（P＞0.05）。p-ERK和p-AKT 蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05），AKT和ERK 蛋白表達無明顯改變（P＞0.05，圖4）。

圖3 PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR 細胞的形態差異Fig.3 The morphological differences between PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cells

圖4 western blot 檢測PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR 細胞的相關蛋白表達Fig.4 The expressions of relative proteins in PC-9∕ZD 和PC-9∕ZDOR cells

2.6 細胞獲得性耐藥后對不同化療藥物敏感性與親本細胞相比，耐藥細胞株PC-9∕ZDOR 對化療藥物多西他賽、吉西他濱、紫杉醇敏感性增加（P＜0.05），而對培美曲塞、順鉑的敏感性無明顯變化（P＞0.05，表1）。

表1 PC-9∕ZD 細胞和PC-9∕ZDOR 細胞的藥物敏感性Tab.1 The sensitivity of themotherapeuticdrugs in PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cell line（n=3） ±s

表1 PC-9∕ZD 細胞和PC-9∕ZDOR 細胞的藥物敏感性Tab.1 The sensitivity of themotherapeuticdrugs in PC-9∕ZD and PC-9∕ZDOR cell line（n=3） ±s

藥物多西他賽吉西他濱培美曲賽紫杉醇順鉑IC50（nmol∕L）PC-9∕ZD 0.476±0.067 21.257±1.059 51.890±6.698 2.205±0.225＞100 000 PC-9∕ZDOR 0.074±0.021 7.878±0.478 55.233±1.341 1.203±0.341＞100 000耐藥指數0.154 0.371 1.064 0.545-

3 討論

本研究選取的NSCLC PC-9∕ZD 細胞株為吉非替尼獲得性耐藥細胞株［11］，二代測序證實為19 外顯子突變合并T790M 突變耐藥細胞株，通過體外遞增藥物濃度的方法建立奧希替尼獲得性耐藥細胞株PC-9∕ZDOR，其RI 為44，在停止給藥6 個月后耐藥細胞株仍保持相似耐藥性，提示體外國內首次成功建立伴T790M 突變一代EGRF-TKI 耐藥后三代EGRF-TKI 耐藥細胞模型。

進一步對本研究中耐藥細胞株PC-9∕ZDOR 進行NGS 檢測分析EGFR 基因突變及Western blot 檢測EGFR 蛋白表達，結果顯示，與親本細胞相比，原EGFR 基因突變（p.E746_A750del 和T790M）消失，無EGFR 擴增及其他新的EGFR 相關基因突變。PC-9∕ZDOR 細胞株EGFR 及其磷酸化蛋白表達呈顯著減少，其下游信號p-ERK 和p-AKT 蛋白表達水平明顯下降。結果表明EGFR 靶點的丟失可能是第三代EGFR-TKIs 獲得性耐藥的主要機制之一，與國外報道一致。KIM 等［12］研究發現，吉非替尼耐藥后出現T790M 突變后服用奧希替尼后變為EGFR 野生型。MIZUUCHI 等［13］的研究中也報道HCC827∕ER 厄洛替尼耐藥細胞株（19del+T790M+EGFR amp）經EGFR T790M 抑制劑CNX2006 處理后，出現EGFR 擴增消失的情況。THRESS 等［14］的研究中報道患者在奧希替尼獲得性耐藥后T790M突變消失。這些結果表明EGFR 靶點的丟失導致臨床獲得性耐藥性產生后繼續應用EGFR-TKIs 治療效果不佳。

已報道的第三代EGFR-TKIs 的耐藥機制除T790M 減少或消失［14］、EGFR 新發突變（C797S、L718Q、G796R 等）［14-16］、旁路信號途徑激活［12，17-18］外，還與細胞出現EMT 表型有關［19］。本研究中與親本細胞PC-9∕ZD 相比，耐藥細胞PC-9∕ZDOR 中的上皮標志物E-Cadherin 和N-Cadherin 的蛋白表達量明顯減少，但間質標志Vimentin 的蛋白表達量未見增加。說明耐藥細胞株PC-9∕ZDOR并未出現EMT。

化療是目前第三代EGFR-TKIs 耐藥進展患者的主要治療方法之一，本研究發現與親代PC-9∕ZD細胞相比，PC-9∕ZDOR 細胞株對化療藥物多西他賽、吉西他濱、紫杉醇敏感性增高，而對培美曲塞、順鉑敏感性無明顯變化。TANG 等［20］的體外研究結果也提示對奧希替尼耐藥細胞株H1975∕OSIR表現出對紫杉醇的敏感性增高，而對培美曲賽的敏感性無變化，與本研究結果一致。KIM 等［12］的臨床研究亦顯示奧希替尼進展的患者對紫杉醇的高敏感性。本研究和既往研究結果提示對奧希替尼耐藥的肺癌對紫杉類化療較敏感，對臨床晚期NSCLC 經奧希替尼治療后進展的患者選擇合適的化療藥物有一定參考意義，但仍需進一步多中心臨床研究來證實。本研究結果還提示奧希替尼耐藥的PC-9∕ZDOR 細胞株對吉西他濱敏感，目前國內外未見無類似報道，仍需擴大研究來證實。

綜上所述，本研究通過奧希替尼逐步遞增劑量，國內首次成功誘導伴T790M 突變的一代EGRF-TKI 耐藥后三代EGRF-TKI 耐藥細胞模型，發現其耐藥機制可能與EGFR 基因突變消失和（或）EGFR 及其磷酸化蛋白表達顯著減少、EGFR 信號蛋白p-ERK 和p-AKT 減少有關，耐藥后細胞株對紫杉類、吉西他濱化療藥物敏感性增加。本研究為研究奧西替尼耐藥機制提供了可靠的細胞模型，也為臨床治療三代EGRF-TKI 耐藥方案的選擇提供參考依據。鑒于本研究只采用一個細胞株，未能全面概括不同亞型細胞對奧西替尼的耐藥機制，結果有待進一步擴大研究并在臨床加以證實。