鈣調蛋白依賴性激酶IIγ RNA干擾載體構建及對破骨細胞分化和骨吸收的影響

王藝睿 王會 戚孟春 董偉 馮曉潔 孫紅

華北理工大學1口腔醫學院口腔頜面外科教研室，2基礎醫學院病理教研室（河北唐山063000）

破骨細胞分化與功能異常在牙周炎、骨質疏松等多種骨過度吸收疾病中起重要作用［1-2］。抑制破骨細胞介導的骨吸收是這些疾病治療的重要途徑，因而調節破骨細胞分化的研究很重要。鈣離子∕鈣調蛋白依賴性激酶II（Ca2+∕calmodulin- dependent protein kinase II，CaMKII）是胞內Ca2+信號傳遞的關鍵信號分子［3］；在CaMKII 諸多異構體中，CaMKIIγ 在破骨細胞分化中表達較高［4-5］，提示其作用非常關鍵；但其具體作用及分子機制目前尚不清楚。本研究通過構建CaMKIIγ 慢病毒干擾載體，研究其對破骨細胞分化及骨吸收的影響，以探索CaMKIIγ 對破骨細胞分化的影響，后期分子機制研究及骨過度吸收性疾病的治療以此為實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗用品 小鼠RAW264.7 細胞株，上海細胞庫，中國；核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），Biovision，美國；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphotase，TRAP）染色試劑盒，Sigma，美國；CaMKIIγ 單克隆抗體，Abcam，日本；PCR 引物，博尚生物，中國；慢病毒載體，上海吉凱基因公司，中國。

1.2 CaMKIIγ 干擾載體構建及轉染效率測定針對CaMKIIγ 基因編碼序列（NM-001039139），根據RNAi 設計原則篩選3 個RNAi 靶點，序列分別為：#1，5′-TAGAGTGCTTACGCAAATT-3′；#2，5′-TTGCTGCTGGCGAGTAAAT - 3′ ；#3，5′ - ACGCAGGAATATGCTGCAA-3′。以5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′序列為RNAi 陰性對照。將合成的干擾序列與攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒載體pGCSIL-GFP連接形成#1、#2、#3重組干擾載體，并包裝與輔助載體pHelper 2.0共轉染293T 細胞；提取重組病毒液，放置-80 ℃備用。以上由上海紀凱基因公司協助完成。

在感染復數（multiplicity of infection，MOI）值分別為1、10、30、50下，用陰性載體轉染RAW264.7 細胞，12 h 后換新鮮培養基；轉染5 d 后激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）下觀察GFP 表達情況，確定最適MOI值，計算轉染效率（GFP 陽性細胞數∕所測細胞總數×100%）。

1.3 重組載體干擾效率測定

1.3.1 實驗分組 RAW264.7 細胞按5 × 103∕孔接種到直徑為30 mm 的培養皿中培養。細胞分為5組，分別為對照組（未用病毒轉染）、陰性載體轉染組、#1、#2、#3 干擾載體組。轉染12 h 后，更換含有50 ng∕mL RANKL、10%FBS 的DMEM 培養基繼續培養，誘導向破骨細胞分化；于第5 天收獲細胞進行干擾效率檢測。

1.3.2 實時熒光定量PCR 檢測 5 組細胞提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，PCR 儀上進行變性、退火、延伸；引物序列：CaMKIIγ（409 bp），正義鏈5′-GCATGTACCC ACAAAGGGGT-3′，反義鏈5′-GCTGGCTCCATACTCTGTAGTTC-3′；β-actin（186 bp），正義鏈5′-GTTG GAGCAAACATCCCCCA-3′，反義鏈5′-CGCGACCAT CCTCCTCTTAG-3′。反應條件：95 ℃30 s，95 ℃15 s，55 ℃20 s，72 ℃20 s，45 cylces。用Rotor-Gene 軟件分析5 組CaMKIIγ mRNA水平，確定#1、#2、#3 病毒mRNA 干擾效率。

1.3.3 Western blot 檢測 提取需測細胞的總蛋白，測濃度，加上樣緩沖液，100 ℃變性；蛋白上樣后，電泳，轉膜，室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育2 h；對照為β-actin；顯影，用成像系統采集圖像，分析蛋白條帶吸光度值，并計算其與β-actin 吸光度值的比值，作為該組CaMKIIγ 蛋白表達水平。

1.3.4 CaMKIIγ RNA 干擾對破骨細胞生成及骨吸收功能的影響 實驗分組：細胞分為對照組、陰性載體組、干擾載體組（使用干擾效率最佳的干擾載體）。TRAP 檢測：細胞按5 × 103∕孔接種到30 mm 直徑的培養皿中，按1.3 方法轉染并繼續誘導培養。誘導5 d 后，收獲細胞并按照試劑盒說明書進行TRAP 染色，200 倍顯微鏡下觀察。每張細胞爬片隨機取6 個視野，計算TRAP+且胞核≥3 個的細胞數目，取其平均值；每組測量3 個細胞爬片。骨吸收陷窩檢測：用離體牙制備1 mm 厚牙本質磨片；細胞按5 × 103∕孔接種到有牙本質磨片的24 孔板中。培養方法同TRAP 染色。7 d 后收獲牙本質磨片，掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）觀察；500 倍下每個磨片上選6 個視野，測骨吸收陷窩總數及總面積，取均值，作為該磨片吸收陷窩數目及面積；每組測3 個磨片。

1.4 統計學方法 定量數據用均數± 標準差表示，SPSS 17.0 軟件統計分析。單因素方差分析比較多組定量數據，LSD 法進行多組內兩兩比較；P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CaMKIIγ 干擾載體構建及轉染效率測定本研究成功構建了3 個CaMKIIγ RNA 干擾載體。用陰性載體轉染RAW264.7 細胞，綠色熒光蛋白（GFP）隨MOI 值增加表達增強。MOI 值為1、10、30、50 時，病毒轉染效率分別為4.0%、12.2%、80.9%、87.1%（圖1）；但MOI 值為50 時，部分細胞變形、崩解，故本實驗確定病毒最佳MOI 值為30。

2.2 CaMKIIγ RNA 干擾效率測定

2.2.1 PCR 檢測mRNA 水平干擾效率 在qPCR儀上進行CaMKIIγ 基因及管家基因β-actin 的PCR反應，將對照組中第一個復孔的mRNA 表達量定義為1，則#1、#2、#3 干擾載體組相對于對照組的mRNA 水平分別為0.377 ± 0.031、0.477 ± 0.042 和0.230 ± 0.020，較對照組（1.100 ± 0.089）均顯著降低（P ＜0.01），分別下降了64.20%、54.61%和78.16%；而陰性載體組（1.053± 0.416）與對照組比較差異無統計學意義（P ＞0.05）。上述結果提示，#3 干擾載體組mRNA 干擾效率最佳。

圖1 陰性載體轉染RAW264.7 細胞后最佳MOI 值確定（激光共聚焦顯微鏡，×200）Fig.1 Determination of optimal MOI value in RAW264.7 cells after transfection with negative vector（LSCM，×200）

2.2.2 Western blot 檢測CaMKIIγ 蛋白表達水平RAW264.7 細胞經病毒轉染5 d 后，蛋白質印記檢測顯示，#1、#2、#3 干擾載體組CaMKIIγ 蛋白表達較對照組明顯降低（圖2）。定量分析表明，#1、#2、#3 干擾載體組蛋白表達光密度值與內參β-actin 光密度值的比值分別為0.579 ± 0.104、0.404 ± 0.088和0.374 ± 0.108，較對照組（1.134 ± 0.141）分別下降了48.94%、64.37%和67.02%（P ＜0.01）；而陰性載體組與對照組（0.988 ± 0.073）無明顯差別（P ＞0.05）。上述結果說明，#1、#2、#3 干擾載體對CaMKIIγ 蛋白表達進行了有效干擾，其中#3 干擾載體效果最佳。上述結果與mRNA 表達一致，因此選用#3 干擾載體用于下一步實驗。

2.3 CaMKIIγ RNA 干擾對破骨細胞生成及骨吸收的影響 TRAP 染色陽性多核破骨細胞在3 組細胞中均出現；其中對照組和陰性載體組多核破骨細胞數較多，體積較大，而干擾載體組破骨細胞數目較少，體積較?。▓D3）。定量分析表明（表1），干擾載體組破骨細胞數較對照組下降了59.99%（P ＜0.01）；而陰性載體組與對照組間差異無顯著性（P ＞0.05）。上述結果提示，CaMKIIγ RNA 干擾可顯著抑制破骨細胞生成。

圖2 蛋白質印記法檢測5 組CaMKIIγ 蛋白表達Fig2 Detection of CaMKIIγ protein expression in five groups by Western-blot

SEM 顯示，3 組細胞均出現了不同數量的骨吸收陷窩，但干擾載體組較其他兩組骨吸收陷窩數目較少、面積較?。▓D3）。定量分析顯示（表1），干擾載體組骨吸收陷窩數目及面積較對照組分別下降了54.19%和57.94%（P ＜0.01）；而陰性載體組與對照組比差異無統計學意義（P ＞0.05）。上述結果表明，CaMKIIγ RNA 干擾可顯著抑制破骨細胞骨吸收功能。

3 討論

原發性∕轉移性骨腫瘤、牙周炎、種植體周圍炎、骨質疏松等疾病中的骨吸收均與破骨細胞分化與功能異常有關，因而破骨細胞分化調控研究是國內外學者關注的焦點。RANKL 作用于破骨細胞膜受體RANK 并募集胞內TRAF（TNF receptor-associated factors），進而通過Ca2+、NF-κB、MAPKs、Akt 等信號通路調控破骨細胞分化［6］。有研究已經確定NF-κB 途徑是CaMKIIδ 和CaMKIIγ 下游激活的主要信號通路之一［7］。CaMKII、CaMKIV 均是胞內Ca2+信號傳遞的關鍵分子［3，6］。PARK-MIN［8］及WILLIAM 等［9］研究發現，RANKL 可促進破骨細胞分化早期CaMKII 磷酸化，提高其蛋白活性，提示其在破骨細胞分化中也可能發揮關鍵作用。

圖3 3 組破骨細胞生成（上排，TRAP 染色，×200）及牙本質吸收陷窩（下排，SEM，×500）Fig.3 Detection of osteoclastogenesis（upper row，TRAP staining，×200）and absorption lacunaes on dentin slices（lower row，SEM，×500）in three groups

表1 破骨細胞計數及牙本質磨片吸收陷窩定量分析Tab.1 Quantitative analysis of osteoclast number and dentin resorption lacunaes（n=3） ±s

表1 破骨細胞計數及牙本質磨片吸收陷窩定量分析Tab.1 Quantitative analysis of osteoclast number and dentin resorption lacunaes（n=3） ±s

注：與對照組比較，aP ＜0.01

分組對照組陰性載體組干擾載體組F 值P 值破骨細胞數（個）26.670±1.528 23.330±2.517 10.670±1.528a 58.303＜0.01吸收陷窩數（個）16.000±1.000 13.670±1.528 7.330±1.528a 31.941＜0.01吸收陷窩面積（μm2）1 1701.000±361.805 1 1191.000±286.606 4 922.000±64.086a 590.703＜0.05

CaMKII 有α，β，γ 和δ 四個異構體［10］。YAO等［4］研究發現，CaMKIIγ 在破骨細胞分化的第3、5天表達上升，而在分化結束時恢復正常，從而認為其主要在破骨細胞分化早期階段發揮作用。而ANG 等［5］研究顯示，CaMKIIγ 在RANKL 誘導的破骨細胞分化中一直穩定高水平表達，而CaMKII 其他異構體及CaMKIV 不表達或表達水平較低。CaMKIIγ 在破骨細胞分化中表達水平較高，且呈時間依賴性表達增強，其表達規律與CaMKIIδ 相似［7］。本課題組前期研究發現，CaMKIIδ RNA 干擾能夠使破骨細胞受到抑制，而且TRAP、NFATc1、c-Src（非受體酪氨酸激酶）等破骨細胞分化相關因子的基因表達下降；CaMKIIδ 過表達對破骨細胞分化和骨吸收無明顯影響［11］。破骨細胞是由分化的巨噬細胞形成的多核細胞，具有破骨功能。TIMMINS等［12］研究發現巨噬細胞中的CaMKIIγ 活化可以引發細胞凋亡。上述研究均說明CaMKIIγ 在破骨細胞分化調控中可能發揮重要作用；然而，其發揮的作用及可能的下游信號分子目前還知之甚少。

為了進一步探索CaMKIIγ 在破骨細胞分化中的作用，本實驗應用慢病毒構建CaMKIIγ RNA 干擾載體；結果發現，CaMKIIγ 基因沉默可顯著抑制破骨細胞生成及骨吸收功能，使破骨細胞數較對照組下降了59.99%，骨吸收陷窩數目和面積分別下降了54.19%和57.94%，提示CaMKIIγ 在破骨細胞分化中發揮著關鍵調控作用；該研究結論與Ang等的研究相一致。ANG 等［5］應用CaMKs 特殊抑制劑KN93、KN62 顯著抑制了RANKL 誘導的破骨細胞生成、骨吸收及Cathepsin K 表達；而應用抑制劑KN92（對CaMKII 不起作用）則對破骨細胞生成無顯著影響；由于該研究同時證實在破骨細胞分化中CaMKIIγ 表達較高，而CaMKII 其 他 異構體及CaMKIV 不表達或表達水平較低，因而支持本研究CaMKIIγ 在破骨細胞分化中起關鍵調控作用的結論。

有關CaMKII 對破骨細胞分化調節的機制，目前還知之甚少，可能與MAPK、CREB、Akt 等信號分子有關。

MAPK 家族包括信號分子ERK、JNK 和P38。ERK 的磷酸化對破骨細胞存活非常重要［13］；同時ERK 的持續活性可誘導integrinαvβ3 表達從而在破骨細胞分化的細胞融合階段發揮作用［14］。YAO等應用CaMKs 抑制劑KN93 處理骨髓單核細胞，發現其顯著抑制早期RANK 下游信號分子中ERK 和Akt 蛋白活化［15］；認為CaMKII 可能通過調節ERK和Akt 影響破骨細胞早期分化［4］。ANG 等［5］研究顯示，CaMKs 抑制劑KN93 和KN62 可顯著抑制破骨細胞內RANKL 誘發的CREB 轉錄活性及ERK 磷酸化，提示二者在CaMKII（γ）介導的破骨細胞分化中發揮關鍵作用。由于MAPK 是RANK 下游信號分子，因而CaMKII 通過ERK 與RANK 間存在信號相互作用。PARK-MIN 等［8］也提出，在MEKERK 信號傳導途徑中RANK 和CaMKII 之間存在交叉。我們前期研究發現［16］，CaMKIIδ 基因沉默可顯著抑制破骨細胞生成及骨吸收，并下調CREB、ERK、JNK、P38 蛋白磷酸化水平；而ERK、JNK、P38特異抑制劑對破骨細胞分化產生相似的抑制作用，從而說明這些信號分子參與了CaMKIIδ 對破骨細胞分化的調控，同樣說明CaMKII 和RANK 之間存在信號交叉。在神經細胞中CaMKIIγ 將Ca2+∕鈣調蛋白從神經元表面轉運到細胞核，使CREB 磷酸化和基因表達［17］。前面提到CaMKIIγ 表達規律與CaMKIIδ 相似，是否CREB、ERK、JNK 等信號分子參與CaMKIIγ 對破骨細胞分化的調控，其調控的分子機制有待進一步研究。

總之，本研究成功構建了CaMKIIγ 慢病毒干擾載體，并證實CaMKIIγ 可顯著抑制破骨細胞分化及骨吸收功能，提示CaMKIIγ 在破骨細胞分化中發揮關鍵調控作用，為后期CaMKIIγ 的相關信號分子機制研究及臨床治療骨吸收性疾病提供實驗依據。