核轉錄因子-κB-基質金屬蛋白酶-9 信號通路在急性一氧化碳中毒遲發性腦病中的作用

彭紅艷 辜剛鳳 雷蕊綺 蔣力 呂霞 吳沙 李經倫

西南醫科大學附屬醫院神經內科（四川瀘州646000）

急性一氧化碳中毒已成為全球中毒死亡的主要原因之一。幸存的患者中，約有10%～30%的人在數天或數周的“假愈期”后出現遲發性腦病，表現為學習記憶力減退、精神行為異常、震顫麻痹綜合征等神經系統后遺癥［1-2］。近期研究表明急性一氧化碳中毒遲發性腦?。╠elayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）的發病機制與缺氧缺血、氧化應激、炎癥與免疫、細胞凋亡等有關［3-4］。CO 通過與血紅蛋白結合導致組織缺氧，從而誘發氧化應激和炎癥反應。氧化應激信號轉導通路主要有核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）、P38MAPK、JNK∕SAPK等［5-6］，其中NF-κB的激活是最原始的信號激活事件［7-8］，而基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是其下游的重要炎癥因子，可通過改變突觸可塑性影響學習記憶力。趙喆等［9］研究表明糖尿病可通過激活NF-κB-MMP-9信號通路，參與糖尿病認知功能障礙，且MMP-9 與糖尿病認知功能障礙呈正相關。DEACMP 亦存在認知功能障礙，MMP-9與該病的關系在突觸重塑方面暫不明確，故本研究通過建立DEACMP大鼠模型動態觀察海馬神經元形態學、突觸超微結構、大鼠行為學變化來探討NF-κB-MMP-9信號通路在其發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及儀器 體積分數為99.9%的CO 氣體（西南化工研究所）；吡咯烷二硫代氨基甲酯（PDTC，美國sigma 公司）；兔抗NF-κB 抗體（#8242，CST）；鼠抗MMP-9 抗體（AB58803，abcam）；Morris 水迷宮跟蹤分析系統（西南醫科大學公共衛生學院）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 成年健康雄性SD 大鼠［體質量（250±20）g，清潔級］150 只（西南醫科大學實驗動物中心）隨機分成3 組：空氣組（AC 組）、CO 中毒組（CO 組）、PDTC + CO 中毒組（PC 組），每組50 只，各組大鼠按染毒后第1、3、7、14、21 天均分為5 個亞組。

1.2.2 建立動物模型 參照何林等［4］的方法采用改良式腹腔注射法復制DEACMP 模型。CO 組大鼠首次按100 mL∕kg 注射CO 氣體，此后每間隔4 h注射1 次，追加劑量為每次50 mL∕kg，共注射4次。AC 組大鼠采用同樣方法注射等量空氣。PC組于復制DEACMP 模型前1 h 腹腔注射PDTC 100 mg∕kg，造模后每天注射1 次，直至處死。

1.2.3 Morris 水迷宮實驗 參照MORRIS 等的方法行水迷宮實驗，包括定位航行和空間探索兩部分。定位航行試驗檢測大鼠學習記憶能力，主要觀察大鼠平均逃避潛伏期?？臻g探索實驗檢測大鼠空間位置記憶能力，主要檢測大鼠穿越平臺次數。

1.2.4 取材 將3組大鼠于各時間點隨機選取一半（5只）斷頭處死后于冰面上分離海馬組織，其中3對放入-80 ℃冰箱中備用，另2對放入2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定。另一半大鼠于腹腔注射10%水合氯醛（3 mL∕kg）進行麻醉，經生理鹽水（9 g∕L，200 mL）灌注、多聚甲醛（4%，300 mL）固定后剝離取腦。

1.2.5 組織學檢測 常規石蠟包埋、切片，予以脫蠟，然后用乙醇脫水，行HE 染色，于光鏡下觀察海馬CA3 區細胞形態學變化。

1.2.6 RT-PCR 檢測MMP-9 基因表達 按Trizol抽提試劑說明書進行提取樣本中MMP-9 總RNA，cDNA 第一鏈合成試劑盒進行反轉錄。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參，應用SYBR Green 法進行實時熒光定量PCR 檢測MMP-9 mRNA 表達水平。引物序列及擴增產物長度見表1。

表1 引物序列及擴增產物長度Tab.1 Primer sequence and length of amplified product

1.2.7 免疫熒光檢測NF-κB、MMP-9 的表達 石蠟切片經脫蠟、梯度乙醇脫水后，于PBS 緩沖液中漂洗，然后置于EDTA 緩沖液中微波修復，經BSA封閉。先后加入一抗、二抗，DAPI 染液，漂洗后用抗熒光淬滅劑封片，及時在熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2.8 Western Blot 檢測NF-κB、MMP-9 的表達 將備用的海馬組織剪成小塊置于勻漿器中制備勻漿，超聲裂解組織，離心后測定蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳，經過轉膜、封閉、抗體孵育后，用Western blot 發光檢測試劑盒顯影、定影，凝膠成像系統收集圖像，最后進行分析。

1.2.9 透射電鏡觀察海馬神經元突觸變化 將已被2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定的海馬組織于1%四氧化餓中固定至標本變黑。丙酮梯度脫水、包埋，切片后染色（檸檬酸鉛和醋酸鈾雙重染色），于透射電子顯微鏡下觀察標本的超微結構。

1.3 統計學方法 計量資料用x ± s表示，應用SPSS 23.0 軟件進行數據分析。水迷宮實驗數據用重復測量資料的方差分析，免疫熒光、RT-PCR 多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型建立 CO 組大鼠首次注射CO 時，大多數呼吸急促，易激惹，到處亂竄，沖撞鼠籠（部分大鼠有唇鼻部撞傷），少數精神萎靡，肢體癱軟，活動減少，喜蜷縮于角落。隨CO 的追加，部分大鼠出現肢體抽搐，伴大小便失禁，部分大鼠反應遲鈍，嗜睡，甚至昏迷，將大鼠置于空氣中后，意識障礙輕者可逐漸恢復，重者仍死亡。病死率為8∕150，其中CO 組6 只，PC 組2 只，AC 組無死亡，死亡大鼠予以備用大鼠補充。造模過程中可見大鼠口唇黏膜、鼻部呈現櫻桃紅色。PC 組大鼠表現與CO組類似，AC 組未出現上述變化。

2.2 Morris 水迷宮實驗 AC 組與PC 組大鼠運動軌跡趨勢與之相反。CO 組大鼠于1、3、7 d 時平均逃避潛伏期、穿越平臺次數與AC 組、PC 組比較差異均無統計學意義（P＞0.05），14 及21 d 時大鼠平均潛伏期較AC 組、PC 組顯著延長（P＜0.05），穿越平臺次數明顯減少（P＜0.05）。PC 組與AC 組比較差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 HE 染色 AC 組大鼠海馬CA3 區神經細胞排列緊密，細胞層厚度正常，神經元呈圓形或橢圓形，核膜完整，核仁清晰，細胞核呈淡藍色，各時間點無明顯變化。CO 組大鼠神經細胞隨時間變化逐漸發生凋亡、壞死，于第7～14 天明顯，主要表現為神經元胞體皺縮，胞漿呈嗜伊紅，核仁深染偏位，甚至發生核固縮、核碎裂，胞質與胞核界限不清，細胞周圍出現空隙（圖1）。PC組病變程度介于兩者之間。

圖1 第14 天海馬CA3 區凋亡神經元（×400）Fig.1 The apoptosis of neurons in hippocampal CA3 area at 14th day（×400）

2.4 RT-PCR CO 組大鼠于第3 天時MMP-9 mRNA 擴增達高峰，7 d 時開始減少。PC 組各時間點MMP-9 mRNA 均低于CO 組（P＜0.05），但仍高于AC 組（P＜0.05，圖2）。

2.5 免疫熒光 CO 組NF-κB 的表達呈增高（1 d）-快速增高（3 d）-緩慢增高的趨勢（圖3）。MMP-9的表達呈染毒后先增高（3 d 峰值），再降低（7 d）的趨勢（圖4）。PC 組NF-κB、MMP-9 的表達均受到限制，與CO 組、AC 組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.6 Western Blot 檢測 AC 組大鼠各時間點海馬區NF-κB、MMP-9 表達極少，且無明顯變化（P＞0.05）。CO 組及PC 組隨時間變化發生顯著變化（P＜0.05），見圖5。

圖2 各組大鼠不同時間點MMP-9 mRNA 的表達Fig.2 The expression of MMP-9 mRNA at different time point in each group rats

2.7 電鏡下突觸超微結構 AC 組各時間點神經元突觸無顯著異常。CO 組：1 ～3 d 大鼠海馬神經元突觸無明顯變化，7 ～21 d 時逐漸出現突觸前后膜腫脹，突觸小泡稀疏、減少，各種程度的細胞質、線粒體水腫，線粒體棘減少且排列紊亂，突觸間隙變窄、模糊不清（圖6），上述表現于第14 天最明顯。PC 組病變程度介于另兩組之間。

圖3 第14 天海馬NF-κB 的表達Fig.3 The expression of NF-κB in hippocampus area at 14th day

圖4 第14 天海馬MMP-9 的表達Fig.4 The expression of MMP-9 in hippocampus area at 14th day

3 討論

NF-κB 是一種快反應轉錄因子，可參與機體正常的免疫和炎癥反應，亦可參與過度炎癥反應、細胞凋亡、突觸重塑等過程。通常所說的NF-κB指的是P50∕P65 異源二聚體，該二聚體與κB 家族的抑制劑IκB 結合為三聚體，并以無活性復合物的形式存在于靜息細胞的胞漿中［10-12］。當細胞受到缺氧等刺激激活時，NF-κB 三聚體中IκB 可解離出來，暴露P50 亞基的異位信號和P65 亞基的DNA 結合位點，表現出NF-κB 活性，活化后的NF-κB 從細胞漿易位到細胞核內，與下游靶基因結合，發揮其轉錄調控的重要作用。PDTC 是具有抗氧化作用的穩定化合物，是NF-κB的特異性抑制劑。MMP-9是NF-κB 下游的重要炎癥因子，已有研究表明其基因啟動子中包含有一個能夠結合NF-κB P65 亞單位的基因序列［13］。該酶是一種依賴于鋅離子和鈣離子的內源性蛋白水解酶［14］，通常在突觸中產生，并以無活性的MMP-9 酶原形式釋放到細胞外，在細胞外激活后可通過降解細胞外基質引起突觸重塑［15］，降解髓鞘堿性蛋白引起細胞凋亡等。已有研究表明，MMP-9可通過調節正常的神經突觸的可塑性影響學習記憶，亦可因MMP-9 基因及蛋白過度表達而發生神經系統疾病，如癲癇、中風等［16］。

圖5 海馬NF-κB、MMP-9 蛋白免疫印跡法結果Fig.5 Immunoblotting results of NF-κB and MMP-9 proteins in hippocampus

圖6 第14 天海馬神經元突觸超微結構（×104）Fig.6 The synaptic ultrastructure of neurons in hippocampus area at 14th day（×104）

本研究采用改良式腹腔注射法復制DEACMP模型，行Morris 水迷宮實驗發現大鼠在染毒后14～21 d 表現出平均潛伏期顯著延長、穿越平臺次數減少，與同時間點AC 組、PC 組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），提示大鼠染毒后學習記憶力減退。病理結果示染毒后7～14 d 細胞凋亡明顯，大鼠行為學表現晚于其病理學改變，與該病臨床過程基本一致，兩者均可驗證造模成功。

XUE 等［17］研究發現海馬CA3 區對缺氧敏感，且MMP-9 在該區表達較多。本研究中大鼠染毒后第3 天發現海馬CA3 區NF-κB 蛋白表達明顯增加，MMP-9 mRNA 及蛋白均增多，海馬區椎體細胞開始出現凋亡，細胞超微結構正常，Morris 水迷宮實驗各項指標較AC 組、PC 組差異均無統計學意義（P＞0.05），此時大鼠學習記憶能力暫未受到損害，與臨床患者“假愈期”表現一致。提示在中毒后早期NF-κB、MMP-9 升高，可能起保護性作用，以至大鼠中毒后早期表現無明顯異常。其可能與CO 中毒后激活NF-κB 信號通路，在早期產生抗炎作用，促進神經保護性因子的表達，同時突觸亦發生適應性改變，從而對大鼠腦組織起到保護作用。本研究中腦組織缺氧與腦缺血缺氧類似，既往在腦缺血損傷的相關研究中已發現NF-κB 的活化可發揮抗炎作用，從而抑制腦缺血損傷，以顯示出對神經細胞的保護作用［18］。本研究結果與之類似。

隨實驗時間推移，于染毒后7 ～21 d NF-κB 蛋白仍有緩慢增高趨勢，可能與以下因素有關：NFκB 高度活化發生炎癥級聯反應，炎癥正反饋使NF-κB 持續升高并長時間維持；一氧化碳中毒后發生脫髓鞘、細胞凋亡等其他病理因素刺激NF-κB 處于激活狀態。而此時MMP-9 基因及蛋白表達開始減少，但仍高于AC 組，細胞凋亡明顯，突觸超微結構發生改變，出現異常重塑，最終發生遲發性腦病，與水迷宮實驗結果一致。提示NF-κB 持續處于較高水平，可能導致炎癥反應過度激活，對神經系統起到損害作用。本實驗中暫未觀察到NF-κB降低，這可能與實驗時間短有關，其表達變化趨勢有待進一步觀察研究。該時間段NF-κB 仍處于高水平，但MMP-9 mRNA 和蛋白表達開始下降，考慮與細胞凋亡有關，與XUE 等［17］研究結果一致。

本研究顯示應用NF-κB 特異性抑制劑PDTC成功阻斷NF-κB -MMP-9 信號轉導通路后，海馬區NF-κB 及其下游因子MMP-9 減少，神經元凋亡減少，突觸異常重塑減輕，于第14 天明顯，同時Morris 水迷宮實驗顯示14 ～21 d 大鼠平均潛伏期縮短、穿越平臺次數增加，與AC 組比較差異有統計學意義（P＜0.05），提示PDTC 可減輕急性CO 中毒后遲發的學習記憶力損害，持續應用14 d 保護作用明顯，但阻斷該信號通路并不能完全阻止遲發性腦病的發生。表明NF-κB-MMP-9 信號通路僅是參與DEACMP 發病機制中的一條通路。其發病機制復雜，病理生理過程有待進一步研究。同時PDTC 的給藥方式及藥物不同劑量的作用效果亦有待進一步研究。

本研究還發現應用PDTC 阻斷NF-κB 信號通路后，細胞凋亡減少，但根據XUE 等［17］研究可推測，當細胞凋亡減少時，MMP-9 應有所增多，而本研究于7～21 d 細胞凋亡減少后MMP-9 基因和蛋白的表達與CO組比較并未增多，反而少于CO組的表達。這一表現與XUE 等［17］研究存在矛盾，推測MMP-9的表達不僅與細胞活性有關，還與其是否被上游因子激活有關，且是否被激活占據主要地位。

綜上所述，筆者發現NF-κB 及其下游因子MMP-9 參與DEACMP 發生，在染毒早期起保護作用，過量表達時產生損害作用。本研究中使用PDTC 抑制NF-κB 通路，盡管只是部分抑制MMP-9基因及蛋白的表達，但可顯著改善DEACMP 大鼠的認知功能，為今后研究DEACMP 的臨床靶向治療提供了新的實驗依據和方向。