廣西不孕不育人群α-地中海貧血基因分型與篩查結果分析

唐蘭艷 呂福通 柳青 陳一君 謝丹尼

廣西壯族自治區衛生計生委生殖中心（南寧530021）

α-地中海貧血（alpha-thalassemia，α-地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，以小細胞低色素性貧血為主要特征，其發生機制主要是由于α-珠蛋白基因缺陷導致其合成的量部分減少或完全缺失。α+地貧為僅一條染色體上的一個α 基因發生缺失或突變，α 鏈合成部分受到抑制；α0地貧為一條染色體上的兩個α 基因均發生缺失，完全無α 鏈合成，故臨床上α-地貧患者的嚴重程度與α 基因缺陷的數量有關［1］，其中血紅蛋白H ?。╤emoglobin H disease，HbH ?。┡c血紅蛋白Bart's 胎兒水腫綜合征（hemoglobin Bart's hydrops fetalis syndrome，Hb Bart's）對α-地貧患者的危害最大。α-地貧作為全球最常見的單基因遺傳病，在地中海地區、中東、北非以及東南亞國家等多見，而在我國主要分布于廣西和廣東等地［2］。為了提高廣西不孕不育人群進行體外受精-胚胎移植（In-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）前以及孕期保健質量，開展α-地貧篩查、基因診斷、產前診斷以及遺傳咨詢等可有效預防或減少α-地貧患兒出生。本文對到我中心就診的10 020 例不孕不育者進行血液學參數、血紅蛋白電泳以及基因檢測，研究分析該人群α-地貧攜帶率、基因分型與基因頻率分布等情況，可為廣西不孕不育人群α-地貧患者進行IVF-ET 提供依據或數據支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年1月1日至2018年1月31日到我中心就診并進行地中海貧血篩查和基因檢測的不孕不育者10 020 例，其中男2 799例，年齡（35.9 ± 6.3）歲；女7 221 例，年齡（34.0 ±5.0）歲。就診的不孕不育人群絕大多數來自廣西各市縣及鎮，少數來自省外。

1.2 方法

1.2.1 研究策略 所有研究人群空腹8 h 以上并于次日早晨采集外周靜脈血進行血細胞學分析，根據《廣西婚前保健和孕期保健地中海貧血篩查與診斷技術規范（試行）》通知要求，篩查陽性標準為紅細胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）＜82 fl 和（或）紅細胞平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）＜27 pg。篩查陽性者再結合血紅蛋白電泳結果，對血紅蛋白A2（hemoglobinA2，HbA2）＜2.8%者以及臨床醫師懷疑為α-地貧而上述篩查實驗陰性的部分人群進行α-地貧基因診斷。另外HbA2＞3.5%和（或）胎兒血紅蛋白（hemoglobin F，HbF）＞2%者初診為β-地貧，另行β-地貧基因診斷，不納入本研究中。

1.2.2 血液學檢測 使用Sysmex-XS-800i 全自動血液分析儀（希森美康公司，日本）測定MCV、MCH、平均紅細胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）等紅細胞參數；采用Sebiacapillarys 2（Sebia 公司，法國）檢測HbA2和HbF。所有項目均在室內質控在控的條件下進行樣本檢測。

1.2.3 基因檢測 采用核酸提取試劑（離心柱型）進行基因組DNA 提取，試劑由亞能生物技術（深圳）有限公司提供；使用Gap-PCR 技術測定缺失型α-地貧，試劑購自深圳益生堂生物企業有限公司；采用PCR-反向點雜交法測定非缺失型α-地貧，試劑購自亞能生物技術（深圳）有限公司。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據處理分析，計量資料以（x ± s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以例數或百分比表示。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 α-地貧基因分型及基因型頻率 在10 020 例不孕不育受檢者中，通過基因診斷共檢出α-地貧患者624 例，檢出率為6.23%；共檢出19 種基因型，其中以輕型--SEA∕αα 為最常見，其次為靜止型-α3.7∕αα 和αCSα∕αα。結果還顯示，在基因型分別為--SEA∕αα、-α3.7∕αα 和αCSα∕αα 的患者中，男性與女性的構成比差別不大。見表1。

2.2 3種α-地中海貧血表型血液學參數及血紅蛋白電泳結果 靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者MCV 均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者MCV 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧男、女患者MCV 與中間型差異無統計學意義（均P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者MCH 均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者MCH 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧女患者MCH 高于中間型女患者（P＜0.05），輕型α-地貧男患者MCH 與中間型男患者差異無統計學意義（P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者MCHC 均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者MCHC 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧男、女患者MCHC 與中間型差異無統計學意義（均P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者Hb 均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者Hb 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧女患者Hb 高于中間型女患者（P＜0.05），輕型α-地貧男患者Hb 與中間型男患者差異無統計學意義（P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者RBC 均高于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者RBC 低于輕型男、女患者（均P＜0.05），靜止型α-地貧女患者RBC 低于中間型女患者（P＜0.05），靜止型α-地貧男患者RBC 與中間型男患者以及輕型α-地貧男、女患者RBC 與中間型差異均無統計學意義（均P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者紅細胞壓積（hematocrit，HCT）均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者HCT 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧女患者HCT 高于中間型女患者（P＜0.05），輕型α-地貧男患者HCT 與中間型男患者差異無統計學意義（P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者HbA2均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型和輕型α-地貧男、女患者HbA2均高于中間型（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者HbA2與輕型差異無統計學意義（均P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者HbF 之間以及他們與非地貧男性、女性比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表2。

表1 不孕不育人群α-地中海貧血基因分型及分布Tab.1 The distribution of genotypes and genotyping for infertile subjects with alpha-thalassemia

3 討論

α-地貧從表型上可分為靜止型、輕型、中間型或HbH 病和重型或Hb Bart’s 胎兒水腫綜合征，各型的臨床表現存在較大不同，比如α-地貧患者的Hb 濃度可從正常至嚴重貧血（Hb 75 ～155 g∕L），MCV ＜79 fl，MCH ＜27 pg，紅細胞計數可正?；蛟龈撸≧BC 6 ～7 × 1012∕L），HbA2%結果正?；蜉p度降低（正常人參考范圍2.0% ～3.3%）［3］，這取決于非功能性α 基因的數量，可因α 和β 鏈、β-地貧和多個α 基因引起的血紅蛋白變異體之間相互作用的多樣性而導致α-地貧個體結果的差異性。本研究通過比較不孕不育人群α-地貧三種表型血液學參數及血紅蛋白電泳結果發現，靜止型α-地貧男、女患者MCV 和MCH 分別為男MCV：（78.40 ± 3.95）fl，女MCV：（78.83 ± 5.55）fl；男MCH：（25.96 ±1.47）pg，女MCH：（25.69 ± 2.18）pg，與上述結果［3］相似，且輕型及中間型α-地貧患者MCV、MCH 比靜止型更低。另外，靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者MCV、MCH、MCHC、Hb、HCT 和HbA2均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），且MCV、MCH、MCHC、Hb 和HCT 都存在以下規律：靜止型＞輕型＞中間型，說明α 基因突變或缺失的數量越多，α-地貧患者血液學指標結果異常的程度越大；而RBC 均高于非地貧男性、女性（均P＜0.05），在靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者中有逐漸升高的趨勢，說明α-地貧患者RBC 增高的機制可能是由于存在慢性MCH 降低而出現的代償現象，這與VELASCO-RODRIGUEZ 等［4］研究結果相似。在實驗室檢查中，MCV ＜80 fl 通常用于地貧的初步篩查，盡管該截斷值幾乎能篩查出所有α0地貧攜帶者，但約有75%的α+地貧攜帶者不能被檢出［5］。另外大多數輕型地貧攜帶者的血液學指標和血紅蛋白電泳結果通常表現正常，此時α-地貧的漏檢率極高，因此為了進一步明確診斷α-地貧，以便更全面了解該病的臨床表型，有必要對α 基因進行分子診斷。

表2 3 種α-地中海貧血表型血液學參數及血紅蛋白電泳結果Tab.2 The results of hemoglobin electrophoresis and hematologic parameters in three phenotypes of alpha-thalassemia.Data present mean ± SD（standard deviation） ±s

表2 3 種α-地中海貧血表型血液學參數及血紅蛋白電泳結果Tab.2 The results of hemoglobin electrophoresis and hematologic parameters in three phenotypes of alpha-thalassemia.Data present mean ± SD（standard deviation） ±s

項目MCV（fl）MCH（pg）MCHC（g∕L）Hb（g∕L）RBC（х1012∕L）HCT HbA2（%）HbF（%）靜止型男性78.40±3.95 25.96±1.47 331.19±8.27 149.52±9.94 5.77±0.41 45.14±2.67 2.42±0.36 0.64±0.45女性78.83±5.55 25.69±2.18 325.56±8.98 126.94±11.11 4.95±0.37 38.96±2.93 2.19±0.53 0.62±0.42輕型男性65.65±4.05 21.32±1.31 324.81±8.00 139.08±8.08 6.55±0.51 42.82±2.32 2.34±0.33 0.71±0.53女性64.70±4.13 20.85±1.45 322.22±7.20 118.58±8.21 5.70±0.41 36.79±2.25 2.36±0.22 0.69±0.47中間型男性60.43±11.59 18.21±3.39 303.43±24.26 119.71±22.72 6.61±0.93 39.39±5.96 1.41±0.57 0.66±0.26女性61.42±9.95 19.28±2.91 314.75±15.80 104.44±17.52 5.45±0.75 33.09±4.80 1.47±0.69 0.66±0.26非地貧人群男性87.37±4.10 29.62±1.52 339.11±8.60 155.23±9.69 5.25±0.38 45.77±2.56 2.67±0.24 0.51±0.30女性86.87±3.67 28.91±1.41 332.81±7.74 132.87±8.41 4.60±0.34 39.92±2.29 2.58±0.29 0.59±0.33

HbH ?。ㄖ虚g型α-地貧）是一種嚴重而非致命的α-地貧類型，臨床特征為明顯的小細胞低色素溶血性貧血，可能機制是3 個α 基因缺失或缺陷，只能合成少量的α 鏈，引起β 鏈相對增多，形成HbH（β 四聚體，β4），而HbH 是一種不穩定血紅蛋白，易被氧化使β4 解離成游離的單鏈，沉積在紅細胞內后形成包涵體，造成紅細胞膜僵硬易受損而被脾臟破壞吞噬。HbH 病患者通常表現為小細胞低色素性慢性溶血性貧血，但在氧化型藥物、感染、脾腫大或輕度黃疸等因素刺激下可導致急性溶血發作［6］。一般來說，臨床上α-地貧患者的嚴重程度與α 鏈缺陷的程度存在很大關聯，非缺失型α+地貧可能比缺失型α+地貧合成更少的α 鏈，所以這可能是非缺失型α+與α0復合雜合子的HbH病患者通常比缺失型α+與α0復合雜合子HbH 病患者更嚴重的原因［7］。本研究不孕不育人群中HbH 病的檢出率為0.229%（23∕10 020），低于HE等［8］報道廣西百色市HbH 病的檢出率（0.928%），造成兩者差異較大的原因可能是該研究所選取對象的年齡范圍較大（1～45 歲），空間跨度較??；而本研究之對象絕大多數來自廣西各市縣及鎮，還有少數來自外省，空間跨度大，年齡段集中且僅限定為人群中的一小部分（不孕不育者）。但HbH 病的基因型都是以--SEA∕-α3.7為主。

Hb Bart's 胎兒水腫綜合征（重型α-地貧）屬于α-地貧最嚴重的類型，是α0地貧的純合子狀態，4個α 基因缺失致使完全無α 鏈合成，胎兒期即可發生大量γ 鏈聚合形成四聚體γ4（Hb Bart's），該物質對O2具有很高的親合力，極易造成胎兒嚴重缺氧，因此胎兒在妊娠晚期可于宮內窒息或出生后不久死亡。當夫妻雙方都是α0地貧攜帶者時，他們將有25%的機會懷上Hb Bart's 胎兒水腫綜合征的后代，而且此類妊娠女性屬于高風險人群，將面臨出現嚴重并發癥［1］，比如由于胎盤過大或心理負擔過重造成先兆子癇、難產和產后大出血等。一項回顧性研究［1］顯示，廣西壯族自治區Hb Bart's 胎兒水腫綜合征病例的α-地貧基因型絕大多數基因型為--SEA∕--SEA，極少數為--SEA∕--THAI，病例數呈逐年上升趨勢，可能原因有：由于人口健康宣傳教育，群眾追求健康質量的意識觀念已明顯增強；專門針對地貧進行系統培訓學習的專業醫學人才不斷增加；地貧篩查已包括在婚前及產前體檢中；當地政府已為廣西當地居民進行地貧和產前診斷成立了專項基金等。本研究結果顯示不孕不育人群共檢出α-地貧基因型19 種，總攜帶率為6.23%（624∕10 020），而馬升俊等［9］在廣西南寧地區研究中共檢出了15 種α-地貧基因型，總攜帶率略高（8.54%）。本研究除了基因型αWSα∕αα 在女性中占較大比例外，其余基因型在男性與女性之間所占比例相差不大，α0地貧個體占3.02%（303∕10020），其中最常見的基因型為--SEA∕αα，與外省報道的結果相似［10-13］。

由于飲食方式、生活方式、心理壓力以及外界環境等因素的綜合影響，廣西不孕不育患者成為了一個特殊的群體，近年來該群體的數量呈日漸增長趨勢，加之α-地貧在廣西地區具有很高的患病率，α0地貧攜帶率也較高，若與α+或α0攜帶者結合有產下HbH 病或Hb Bart's 胎兒水腫綜合征后代的風險，將給政府、家庭以及小孩造成嚴重的健康與經濟負擔。因此本研究為提高廣西不孕不育人群α-地貧患者進行IVF-ET 前和孕期保健質量提供了一些依據或數據支持，通過篩查、基因診斷、遺傳咨詢、產前診斷等多種手段綜合應用可科學有效預防及避免α-地貧患兒（尤其是Hb Bart's 患兒）的出生，從而達到科學指導優生優育。