梔子提取物分離純化工藝研究

崔龍 胡少銀 劉和平

[摘要] 目的 優選梔子提取物的分離純化工藝參數。 方法 以西紅花總苷轉移率和色價為綜合評分指標，通過單因素試驗和正交試驗設計優選梔子提取物的最佳分離純化工藝參數，并進行工業化生產驗證。 結果 最佳分離純化工藝為：提取液以0.5 mg/mL的濃度上HPD-100A樹脂吸附，依次用12 BV純化水、2 BV的35%乙醇以1 BV/h的流速洗脫除雜，再以同樣的流速用4 BV的65%乙醇洗脫即得梔子提取物。最佳工藝條件下進行中試生產驗證，3批梔子提取物的西紅花總苷轉移率、色價和產率均值分別為86.25%、509.82和2.11%，其RSD值分別為1.56%、0.39%和2.33%。 結論 該梔子提取物分離純化工藝經過工業化生產驗證，穩定、可靠。

[關鍵詞] 梔子;梔子提取物;西紅花苷;柱層析

[中圖分類號] R286.0? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0033-05

梔子提取物是重要的藥物合成原料及中間體，其制劑血脈清片具有降血脂、抗動脈粥樣硬化以及抗腫瘤等作用[1-3]，臨床上常用于治療高脂血癥[4-5]。梔子提取物是以茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的果實為原料，經提取、精制而成的橙紅色至暗棕紅色的粉末，主要含有西紅花苷、西紅花酸，還有少量環烯醚萜苷類的梔子苷及黃酮、綠原酸等化學成分[6];其水溶液在紫外-可見光區440 nm處有特征吸收峰[7]。目前，梔子提取物的制備工藝研究鮮有報道，而食品添加劑梔子黃的分離純化研究報道較多，主要有溶劑提取法、萃取技術、膜分離技術、柱層析純化等多種制備方法[8]，但僅有柱層析法普遍應用于工業化生產。

梔子提取物和梔子黃的主要區別在于西紅花總苷和西紅花苷-Ⅰ的含量。梔子黃中西紅花總苷含量與色價呈良好的正相關，且當梔子黃的色價>500時，即符合梔子提取物的質量要求。本研究以梔子為研究對象，以西紅花總苷轉移率、色價為評價指標，用大孔吸附樹脂HPD-100A對梔子提取液進行吸附，然后通過水、不同濃度的乙醇溶液解吸附，以期達到分離純化梔子提取物的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MS205DU電子分析天平（梅特勒-托利多，0.01/0.1 mg）;UV-2450紫外可見分光光度計[島津（中國）有限公司];N-3010旋轉蒸發儀[埃朗科技國際貿易（上海）有限公司];CS101-2EBN電熱恒溫鼓風干燥箱（重慶四達實驗儀器有限公司）;不銹鋼提取罐（陜西宏達實業有限公司）;HWZ系列單效外循環真空濃縮器（陜西宏達實業有限公司）;MCSZZ-20000不銹鋼樹脂柱（浙江明辰機械科技有限公司）;1500-IS振蕩篩（南京寶威干燥機械設備廠）;FZG低溫真空干燥烘箱（南京祿旺干燥設備有限公司）。

1.2 試藥

西紅花苷-Ⅰ對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111588-201303）;HPD-100A大孔吸附樹脂購自滄州寶恩吸附材料有限公司;乙醇為藥用級，購自中山市華士達化工有限公司;其余試劑均為分析純。

梔子果實（鮮梔子干燥品破碎成4～5 mm的顆粒），購自安徽郎溪縣奕龍梔子種植專業合作社，經國家中藥現代化工程技術中心曹暉教授鑒定為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥果實。

2 方法與結果

2.1 西紅花總苷含量及色價的測定

按照陳陽等[9-11]報道的方法測定梔子提取液或提取物的西紅花總苷含量及色價。

2.1.1 對照品溶液的制備? 精密稱定西紅花苷-Ⅰ對照品6.11 mg，置10 mL量瓶中，加50%乙醇溶液溶解、定容，即得西紅花苷-Ⅰ為0.5658 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備? 取梔子提取液或提取物適量，置200 mL量瓶中，加50%乙醇溶液定容至刻度，搖勻即得（若測定吸光度值不在0.3～0.7，則重新制備）。

2.1.3 測定法? 精密吸取西紅花苷-Ⅰ對照品溶液適量，加50%乙醇溶液適量，定容，制成濃度分別為2.8289、3.5362、5.6579、7.0723、14.1447、28.2893 μg/mL的對照品溶液。以50%乙醇溶液為空白對照，測定對照品溶液在440 nm處的吸光度值（A），以A為縱坐標，西紅花苷-Ⅰ濃度為橫坐標，計算回歸方程?；貧w方程為Y = 101.3800X+0.00591（r = 0.9999），西紅花苷-Ⅰ在2.8289～28.2893 μg/mL范圍線性關系良好。照上述方法，以50%乙醇溶液為空白對照，測定供試品溶液的西紅花總苷濃度，計算西紅花總苷含量及其轉移率。

2.1.4 色價? 以2.1.3項下測得的供試品溶液在440 nm處的吸光度值計算色價。色價=A×f/（100 m），其中A：供試品溶液在440 nm處的吸光度值;f：稀釋倍數;m：試樣質量（提取液以總固物計）。

2.2 HPLC測定西紅花苷-Ⅰ含量

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗? 梔子提取液及提取物中西紅花苷-Ⅰ按照劉和平等[12-14]報道的方法測定。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以甲醇-水（60∶40）為流動相，進樣量：5 μL;流速：1.0 mL/min;柱溫：25℃;檢測波長：440 nm。西紅花苷-Ⅰ的分離度>1.5，理論板數以西紅花苷-Ⅰ計≥2000。見圖1。

2.2.2 溶液制備? 對照品溶液制備：精密稱取西紅花苷-Ⅰ對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL中含西紅花苷-Ⅰ 80 μg的溶液，精密量取3 mL，至100 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。供試品溶液制備：取梔子提取物10 mg，精密稱定，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液1 mL，置20 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 西紅花苷-Ⅰ的標準曲線? 分別精密量取濃度為86.77 μg/mL對照品溶液10、5 μL，濃度為8.677 μg/mL對照品溶液10、5、2.5 μL，以及濃度為0.8677 μg/mL對照品溶液20、10、5 μL，注入液相色譜儀中，按“2.2.1”色譜條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標，以西紅花苷-Ⅰ對照品的量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性方程Y = 20.122X-172.73，R2 = 0.9997。結果表明，西紅花苷-Ⅰ在4.3385～867.7 ng濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.4 精密度? 取“2.2.2”項下的西紅花苷-Ⅰ對照品溶液、供試品溶液，按上述“2.2.1”項下色譜條件，分別連續進樣6次，記錄西紅花苷-Ⅰ的峰面積。其峰面積的RSD值分別為0.87%、0.56%，表明該方法精密度良好。

2.2.5 穩定性? 取梔子提取物及西紅花苷-Ⅰ對照品，分別按“2.2.2”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、1、3、6、12、24、48 h測定，記錄西紅花苷-Ⅰ的峰面積。其峰面積的RSD值分別為1.12%、1.54%，表明供試品溶液及對照品溶液在48 h內基本穩定。

2.2.6 重復性? 取梔子提取物，平行6份，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄西紅花苷-Ⅰ的峰面積。西紅花苷-Ⅰ的含量的RSD值為1.89%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率? 取西紅花苷-Ⅰ對照品，精密稱取50.325 mg，置于20 mL容量瓶中，加甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。另取已知含量的供試品，精密稱取9份，每份10 mg，平均分成3組，分別精密加入上述“2.2.2”項下對照品溶液1、2、3 mL，按上述“2.2.2”項下方法處理后進樣測定，計算西紅花苷-Ⅰ的含量、加樣回收率、RSD值。結果平均回收率為98.48%，RSD為1.62%。見表1。

2.2.8 樣品含量測定? 取3批梔子提取物樣品，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法，分別制成供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。

2.3 提取物提取濃縮、上樣液的制備

取已破碎的梔子干果，依次用6、4、4倍量的50%乙醇溶液在50℃水浴中浸提3次，每次2 h，每隔30 min攪拌1次。合并3次提取液，過300目篩網，即得梔子提取液，提取液經減壓濃縮（≤70℃）至無醇味，再用純化水稀釋至1.0 g/mL（以生藥量計），備用。照2.1項下的方法測定提取液中西紅花總苷含量和色價分別為11.5 mg/mL和61.25。

2.4 提取物柱層析分離純化

2.4.1 樹脂的選擇及其預處理? HPD-100A樹脂是滄州寶恩吸附材料科技有限公司開發的專門用于生產梔子提取物的非極性大孔吸附樹脂。根據既往對D101、D138、D3520、X-5、NKA-9、AB-8、HPD-400等多種樹脂的對比研究[15-20]，發現HPD-100A樹脂對梔子提取物有很好的吸附性和選擇性，故選擇HPD-100A大孔吸附樹脂。根據使用說明書，其預處理方法為：用95%乙醇浸泡樹脂24 h，取適量，裝柱，然后用5 BV的95%乙醇以2 BV/h的流速洗脫，最后用純化水以同樣的流速沖洗至無醇味，備用。

2.4.2 動態吸附曲線的繪制及上樣量的確定? 取梔子提取液，以1 mL/min的流速上樣于已處理好的50 mL的HPD-100A樹脂，分段收集流出液（每段2.5 mL為1份），依次編號，共13份。照“2.1”項下測定流出液中的西紅花總苷的含量。流出液11中西紅花總苷含量明顯增加，故最佳生藥吸附量為0.25 g/mL（以樹脂體積計算）。見圖2。

2.4.3 提取物柱層析分離純化參數考察? 取經預處理好的HPD-100A大孔吸附樹脂，濕法裝柱（柱徑高比1∶3、1∶5、1∶7），取不同濃度（1、0.5、0.33 g/mL）的梔子提取液以0.5 BV/h的流速上柱吸附。然后依次用12 BV純化水、2 BV低濃度乙醇（15%、25%、35%）和4 BV的65%乙醇洗脫，洗脫流速為1.0 BV/h，65%乙醇洗脫液即為梔子提取液。分別照2.1項下的方法測定梔子提取液中西紅花總苷含量及色價，計算西紅花總苷轉移率。①固定上樣濃度為1.0 g/mL、低濃度乙醇濃度為35%，與1∶5、1∶7比較，柱徑高比為1∶3時西紅花總苷的轉移率和色價明顯偏低。②固定上樣濃度為1.0 g/mL、柱徑高比1∶5，隨著洗脫的低濃度乙醇濃度的增加，西紅花總苷的轉移率和色價逐漸升高，同時西紅花總苷的損失也逐漸增加。③固定低濃度乙醇濃度為35%、柱徑高比1∶5，在試驗范圍內，上樣濃度對西紅花總苷轉移率和色價的影響不大。綜合上述結果，選擇35%乙醇洗脫除雜，上樣濃度0.5 g/mL，柱徑高比1∶5分離純化梔子提取物。見表2。

2.4.4 提取物柱層析分離純化正交試驗? 根據單因素試驗結果，以西紅花總苷轉移率和色價為評價指標，以乙醇濃度、洗脫流速、洗脫量為考察因素設計正交表L9（34），優選梔子提取物分離純化的工藝參數。本研究以西紅花總苷轉移率、色價兩個指標綜合評分，權重分別為50%和50%。正交試驗設計表及試驗結果見表3～4。由表4可知，對梔子提取物分離純化的影響大小順序為：A>B>C，即乙醇濃度影響最大;方差分析結果表明，各因素3個水平間差異無統計學意義（P < 0.05）。故優選的最佳純化工藝參數組合為A3B1C2，即乙醇濃度65%、洗脫流速1.0 BV/h、洗脫量4 BV。

2.4.5 提取物柱層析分離純化驗證? 按照優選的工藝參數在實驗室進行了3批梔子提取物分離純化放大試驗。3批驗證試驗西紅花總苷轉移率、色價和產率（以浸出物含量計算）均值分別為90.89%、506.99和2.37%，其RSD值分別為2.13%、0.25%和1.93%，說明純化工藝穩定、可靠。見表5。

2.5 梔子提取物分離純化中試生產

為驗證上述梔子提取物純化工藝參數的穩定性與可靠性，在最佳純化工藝參數條件下，進行了3批中試生產驗證。3批梔子提取物純化中試生產驗證的西紅花苷總轉移率、色價和產率均值分別為86.25%、509.82和2.11%，其RSD值分別為1.56%、0.39%和2.33%，說明該工藝合理可行，適合工業化大生產。見表6。

2.6 梔子提取物中西紅花總苷和西紅花苷-Ⅰ的含量測定

按照“2.1”“2.2”項下測定3批中試樣品中西紅花總苷和西紅花苷-Ⅰ的含量。3批梔子提取物中西紅花總苷含量均>50%，西紅花苷-Ⅰ的含量均>25%，符合原料藥梔子提取物的質量標準的規定。見表7。

3 討論

宋偉等[15]采用HPD-100A大孔吸附樹脂分離純化梔子黃色素，其提取液的色價從34.6升高到384.6，該研究采用水提取的梔子黃色素提取液的色價明顯較低。涂華等[21]利用AB-8、HPD-100A、D101等5種大孔吸附樹脂分離純化梔子黃色素，其提取物的色價高達489，但該研究采用的微波輔助提取法目前難以實現工業化大生產。本研究以新鮮梔子干果為材料，采用合理的試驗設計優選了梔子提取物的分離純化方法，具體工藝參數：梔子提取液經減壓濃縮至質量濃度為0.5 g/mL的藥液，上HPD-100A大孔樹脂柱（柱徑比1∶5）吸附，生藥吸附量0.25 g/mL（以樹脂體積計算），然后以1.0 BV/h的洗脫流速依次用12 BV純化水、2 BV的35%乙醇洗脫除雜，再用65%乙醇洗脫，即得梔子提取液;經減壓濃縮、干燥、粉碎，即得梔子提取物（色價>500、產率=2.11%）。該工藝經3批中試生產驗證，穩定、可靠，適合工業化大生產。

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（收稿日期：2018-03-02? 本文編輯：王? ?蕾）