聚乙二醇-b-聚己內酯/聚己內酯單分散電噴微球的制備與親水性研究

楊 雪 邵華英 張瓊月 吳小紅

(重慶醫科大學附屬口腔醫院, 口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室， 重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶 401147)

引言

緩釋微球是指藥物溶解或分散在高分子材料基質中形成的微小球狀實體。關于微球制劑用于治療口腔常見疾病的研究在近10年得到飛速的發展[1-2]。近年來，用靜電紡絲的方法制備微球(即電噴微球)得到迅速發展，比傳統制備微球有明顯的優勢：設備常規性，成本低，步驟相對簡單，產生的微球單分散性即粒徑一致性佳[3]。高分子載藥微球作為藥物控釋載體材料、吸附劑、表面修飾劑，在包裹親水性藥物時，需對疏水的高分子聚合物進行親水性修飾，更利于細胞黏附[4-5]。

然而，制備單分散性良好、親水性佳的電噴微球，需要研究不同溶液體系下的電噴參數(如電壓、流速以及聚合物和藥物的種類及濃度)對電噴模式的影響，穩定的泰勒錐模式才能形成單分散性良好的微球[3]。聚己內酯PCL是一種被FDA批準的可生物降解的聚酯材料，其最大的優點是降解時間長，可作為長期載藥的組織支架在組織工程中得到應用[6]；同時，PCL對小分子藥物相溶性好，且相比PLGA等高分子材料所降解產生的酸性環境強度弱[7]。PCL制備的微球單分散性更強[8]，也是常用于制備電噴微球的聚合物。由于其極強的疏水性，在包裹親水性藥物時，為了減小突釋，通常要對其進行改性，對進一步提高其包封率、延長藥物緩釋時間很關鍵[9]。雙親類物質一般用于修飾疏水性的PCL，用作對親水性藥物的包裹[10]，雙親材料PEG-b-PCL可用于修飾PCL[11]，性能穩定并具有較好的生物相容性[12]，但目前沒有關于PEG-b-PCL/PCL制備電噴微球的研究。筆者擬用PEG-b-PCL改善PCL親水性，并研究電噴微球隨不同PEG-b-PCL含量(以下簡稱雙親含量)的形態大小、粒徑分布以及親水程度的變化，同時討論能制備出單分散性良好的微球所需要的流速和電壓參數，旨在為進一步制備載藥微球打下實踐基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

靜電紡絲儀(北京永康樂業科技發展有限公司)，掃描電子顯微鏡(Jeol，Japan)，偏光顯微鏡(Nikon，Japan)，常溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)，接觸角測量儀(北京環球恒達科技有限公司)，激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8 CARS, Germany)，圖像分析軟件ImageJ-win64(NIH，USA)。

聚己內酯(Mw=80 000, Sigma)，聚乙二醇-b-聚己內酯(聚乙二醇Mw=2 000，聚己內酯Mw=2 000，山東岱罡生物有限公司)，氯仿(分析純，山東化工)，超純水。

1.2 方法

1.2.1微球的制備

根據不同雙親含量比例(以PCL的重量為參照)進行4% PCL(W/V)溶液配制(見表1)，配好的溶液在室溫下充分攪動2 h后加入裝有21號不銹鋼鈍性針頭的5 mL注射器(溫度23～25 ℃，濕度40%～45% RH)，針頭與高壓直流電源的正極相連，電壓設置變量值為8、10和12 kV，流速設置變量值為0.5、1.0、1.5 mL/h。在與針頭相距20 cm的接收滾筒上接負極，滾筒上覆蓋著鋁箔紙，作為微球的接收器，用于微球收集和電鏡觀察，而蓋玻片接收用來偏光顯微鏡觀察。電噴結束后，接收器置于通風櫥中過夜，讓殘留的有機溶劑揮發，收集到的微球轉移至小玻璃瓶中儲存。

1.2.2微球的形態和大小

收集到微球的鋁箔紙剪成1 cm×1 cm，固定在樣品臺上，旋轉蒸鍍儀噴金，使用掃描電鏡(scanning electron microscope SEM)進行觀察，電子加速度為20 kV；載玻片收集到的微球在偏振光顯微鏡下觀察，用imagej軟件測量微球直徑并計數(>100個/樣本)，結果以均值±標準差表示；微球直徑的單分散性即粒徑分布一致性，用變異系數CV(%)表示，值越低表明微球單分散性即粒徑分布一致性越佳。

CV=標準差/均值 (%)

(1)

表1不同雙親含量的電噴溶液

Tab.1Electrosprayingsolutionswithdifferentamphiphilic

content

含量/%01020電噴溶液S1S2S3

1.2.3接觸角測試

用鋁箔紙收集到的微球直接進行接觸角儀器檢測，每組3個樣本，每個樣本重復測量3次，結果以均值±標準差表示，并采用SPSS 22統計軟件進行單因素方差分析。

1.2.4微球在水中的分散性

雙親含量為0%、10%、20%的微球分別稱取4 mg，分別加入含有4 mL的EP管，渦旋混勻后形成1 mg/mL的微球混懸液，分別取微球混懸液滴于蓋玻片上，采用激光共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope LSCM)觀察微球在水中分散性。

2 結果

2.1 不同雙親含量微球的形態大小

2.1.1不同雙親含量微球的形態

如圖1所示，未加入雙親時，微球表面粗糙(見圖1(a)；加入10%～20%雙親后，微球表面相對光滑(見圖1(b)、(c)；繼續加入雙親30%后，光鏡圖(見圖1(d))可清晰地看見微球之間由纖維連接，沒有形成理想的微球形態，因此沒有進行掃描電鏡的進一步觀察。

圖1 不同雙親含量微球(電噴參數：流速1 mL/h，電壓10 kV)((a)～(c)左為光鏡圖，500×；中和右為掃描電鏡圖，分別為500×和2000×)的光鏡圖和掃描電鏡圖。(a)PCL；(b)PCL/10%雙親；(c)PCL/20%雙親；(d)PCL/30%雙親(光鏡圖，500×)Fig.1 Optical microscopic and SEM pictures of microspheres with different amphiphilic content (electrospraying parameters: flow rate 1 mL/h, voltage 10 kV) ((a)-(c), left side are optical microscopic pictures, 500 times; middle and right side are SEM pictures, respectively 500 times and 2000 times). (a)PCL; (b)PCL/10% amphiphilic content; (c) PCL/20% amphiphilic content; (d)PCL/30% amphiphilic content (optical microscopic pictures, 500 times)

2.1.2不同雙親含量微球的大小

如圖2和表2所示，未加入雙親時，微球直徑為(18.08±5.52)μm；加入10%～20%雙親后，直徑由(6.25±0.94)μm降至(5.52±1.14)μm，微球粒徑分布一致性較好，直徑變異系數值為15%～21%；繼續加入雙親30%后，微球直徑分布較廣，變異系數值為38%，單分散性較差。

圖2 不同雙親含量微球的直徑分布直方圖。(a)PCL；(b) PCL/10%雙親；(c)PCL/20%雙親；(d)PCL/30%雙親Fig.2 Distribution histographs about the diameters of microspheres with different amphiphilic content(n=100). (a) PCL; (b)PCL/10% amphiphilic content; (c)PCL/20% amphiphilic content; (d)PCL/30% amphiphilic content

表2不同雙親含量的微球直徑大小、形態及變異系數(n=100)

Tab.2Size,morphologyandsizedistributionofmicrosphereswithdifferentamphiphiliccontent(n=100)

微球直徑/μm形狀變異系數CV/%PCL18.08±5.52球形31PCL/10%雙親6.25±0.94球形15PCL/20%雙親5.52±1.14球形21PCL/30%雙親4.46±1.68球形+纖維38

2.2 不同流速和電壓微球的形態大小

2.2.1不同流速和電壓微球的形態

當流速固定在0.5 mL/h、電壓為8和12 kV時，微球直徑由絲狀物質連接，在電壓為12 kV時較明顯(見圖3(a)、(c))。但當流速增至1.5 mL/h時，成球性相對較好，均未見絲狀纖維(見圖3(b)、(d))。而當流速為1 mL/h、電壓為10 kV時，微球成球性較好(見圖1(b)、(e))。

2.2.2不同流速和電壓微球的大小

隨著流速增加,微球直徑也相應增加，并且微球直徑與流速的平方根呈線性關系(見圖4(a))。未加入雙親材料時，微球直徑的變化較明顯(從14.4 μm到23.6 μm)，但加入10%和20%雙親后，變化范圍較窄(從4.75 μm到7.3 μm)，然而，加入雙親后，微球直徑的變異系數變低，單分散性提高。當流速1 mL/h時，變異系數CV值最低為15%(見圖4(c))。

隨著電壓從8 kV增加到12 kV，微球直徑呈減小趨勢，加入雙親后的直徑變化不明顯(見圖4(b))， 電壓10 kV時變異系數CV值最低為15%，單分散性相對較佳(見圖4(d))。

2.3 不同雙親含量的微球親水性

未加入雙親時，PCL微球接觸角為126.2°±4.8°；加入10%雙親，接觸角約83.24°±5.65°；加入20%雙親，接觸角約29.9°±4.9°(見表3)。如圖5所示，加入雙親后，微球接觸角減小，3組差別具有統計學意義(P<0.05)。

2.4 不同雙親含量的微球在水中的分散性

如圖6所示，將微球加入水后，不含雙親的微球并未均勻混合于水中，可見到微球于水面聚集，激光共聚焦顯微鏡下微球混懸液也呈現團聚的現象；而加入雙親10%、20%后的微球能形成均勻的混懸液，激光共聚焦顯微鏡顯示微球在水中分散性較好。

表3 不同雙親含量的微球接觸角大小(n=3)

圖3 雙親含量為10%時不同電壓及流速參數下電噴微球的光鏡圖(500×)。(a)8 kV, 0.5 mL/h; (b)8 kV, 1.5 mL/h; (c)12 kV, 0.5 mL/h; (d)12 kV, 1.5 mL/h; (e)10 kV, 1 mL/hFig.3 Optical microscopic pictures of the electrosprayed microspheres with the amphiphilic content fixed at 10% under different parameters of voltage and flow rate (500×). (a)8 kV, 0.5 mL/h; (b)8 kV, 1.5 mL/h; (c) 12 kV, 0.5 mL/h; (d)12 kV, 1.5 mL/h; (e)10 kV, 1 mL/h

圖4 在電壓一定或者溶液流速一定的條件下，3種溶液電噴微球的平均直徑及粒徑分布。(a)電壓為10 kV時，微球直徑隨流速的變化；(b)流速為1 mL/h時，微球直徑隨電壓的變化；(c) 電壓為10 kV時，微球直徑的粒徑分布隨流速的變化；(d) 流速為1 mL/h時，微球直徑的粒徑分布隨電壓的變化Fig.4 Mean diameter and particle size distribution of electrosprayed microspheres of three solutions under certain voltage or flow rate. (a)When the voltage was 10 kV, the size of microspheres varied with flow rate; (b)When the flow rate was 1 mL/h, the size of microspheres varied with voltage. (c) When the voltage was 10 kV, the diameter distribution of the microspheres varied with the flow rate; (d)When the flow rate was 1 mL/h, the diameter distribution of the microspheres varied with voltage

圖5 不同雙親含量的微球接觸角。(a)PCL；(b)PCL/10%雙親；(c)PCL/20%雙親Fig.5 Contact angle of microspheres with different amphiphilic content. (a)PCL; (b)PCL/10% amphiphilic content; (c) PCL/20% amphiphilic content

圖6 不同雙親含量的微球懸浮液(每行左為微球懸浮液的宏觀圖，右為微球懸浮液的激光共聚焦顯微鏡圖，400×)。(a)PCL；(b)PCL/10%雙親；(c)PCL/20%雙親Fig.6 Images of microsphere suspensions with different amphiphilic content (The left side of each row are macrographs of microsphere suspensions; The right side of each row are CLSM images of microsphere suspensions, magnification times, 400 times). (a)PCL; (b) PCL/10% amphiphilic content; (c)PCL/20% amphiphilic content

3 討論

3.1 微球表面形態的影響因素

電噴微球的形成主要由兩個機制控制:溶劑揮發的同時，聚合物高分子鏈纏繞擴散，固化成微球。充分的溶劑揮發和足夠的聚合物擴散，才能形成單分散性、球形的微球。與微球表面特性相關的有兩個指數Pe[3]和φRay[13]，有

(2)

(3)

式(3)中，φray指聚合物體積分數，Q指流速，I指電流，γ指溶液表面張力，體現了電壓、流速對微球形態的影響。φray指聚合物高分子鏈纏繞的聚合物體積分數：當其足夠大時，液滴很難從穩定的結構中逸出產生二級粒子；當其較小時，二級粒子飛逸出被延伸成較細的纖維[15]。

因此，充分的溶劑揮發和聚合物擴散對微球表面形態至關重要。氯仿沸點為61.2°，由圖(1(a))可見，微球表面輕度粗糙；由式(2)可見，當加入雙親物質10%～20%后，微球表面相對光滑，這可能是因為電噴溶液黏彈性降低，聚合物擴散相對加快，在溶劑揮發的過程中，聚合物能得到相對較好的擴散，形成的微球表面相對光滑(見圖1(b)，1(c))。而繼續加入30%雙親后，微球之間由較多纖維連接，這可能是因為微球表面張力減小明顯，φray值減小，容易產生纖維(見圖1(d))。

微球形成過程中，溶劑揮發徹底對形成單分散性良好的微球至關重要，影響溶劑揮發的因素除了溶劑種類還有環境中濕度、溫度及接收距離等[3,16]。從圖(1(a)～(c))中可看到微球之間有明顯的粘連，這可能是由于有機溶劑不能徹底揮發所致[17-18]，微球在接收板上未完全固化，殘余的溶劑使得微球表面由于分子鏈纏繞而發生溶蝕作用，出現了微球的粘連。

當微球流速固定在0.5 mL/h、電壓為8和12 kV時，微球直徑由絲狀纖維連接，在電壓為12 kV時較明顯(見圖3(a)、(c))，這是因為電壓增加，φray值減小，易生成纖維；當電壓固定在12 kV、流速增至1.5 mL/h時，由于φray值增大，成球性相對較好，未見絲狀纖維(見圖3(b)、(d))。因此，高電壓時，適當提高流速有利于微球的形成[13]。

3.2 微球直徑大小的影響因素

影響微球直徑大小的影響因素有很多，比如溶液導電性、流速等，直徑可表示[19]為

(4)

式中，Q指流速，ρ指溶液密度，γ指溶液導電性，σ指溶液表面張力。

該實驗加入雙親PEG-b-PCL，微球粒徑變小(見圖2)。由式(4)所示，這可能是因為所加的雙親試劑含有氫鍵，溶液極性增加，使得溶液導電性增強，微球粒徑變小。同時，加入雙親10%～20%后，微球直徑分布的變異系數變低，這說明電噴狀態穩定，制備的微球單分散性較佳。

流速與微球直徑的平方根呈線性關系(見圖4(a))，意味著理論上微球直徑可以通過流速的變化來控制，這在未加入雙親材料時微球直徑的變化較明顯。但加入10%和20%雙親后，變化范圍較窄，這可能是因為加入雙親后，溶液導電性增加，微球直徑減小，因流速而影響的直徑變化不明顯。加入雙親后，微球直徑的變異系數CV值減小，這是因為此時溶液穩定性提高，制備的微球單分散性增強。流速1 mL /h時， CV值較低，意味著電噴狀態較穩定。

隨著電壓增加，微球直徑呈減小趨勢，加入雙親后的直徑變化不明顯(見圖4(b))，電壓10 kV時單分散性相對較佳(見圖4(d))。這可能是因為電壓增加，電場中的液滴更容易庫倫裂變產生二級粒子，從而使微球直徑相應變??；電壓10 kV時，CV值較低，意味著電噴狀態較穩定。

3.3 微球表面的親水性

雙親材料PEG-b-PCL是由親水的聚乙二醇(PEG)和疏水的聚己內酯(PCL)聚合形成的兩親性嵌段共聚物， 可用于改善PCL的親水性[9]，由圖5可見，雙親含量由0%增至10%和20%時，微球的親水性逐漸上升，微球接觸角由 126.2°±4.8°降至29.9°±4.9°(見表3)。材料表面親水性對調節細胞行為有重要的作用，經過研究表明，細胞在親水的表面黏附以及鋪展更佳[20]。

當微球放入水中時，微球在水溶液中的聚集現象與微球混懸液中的氫鍵、范德華力有關[21]。在該實驗中，當雙親含量為10%～20%的微球放入水中時，微球聚集的現象減輕。而雙親含量為0%的微球的聚集更明顯，宏觀上看微球更多的是貼于水面或管壁，而非均勻混于水中。激光共聚焦顯微鏡下可見：未加入雙親時，微球聚集較明顯(見圖6(a))；加入雙親后，微球分散象較好(見圖6(b)、(c))。這可能是因為當不含雙親時，微球表面疏水，在水中微球聚集成簇，疏水的微球于水液面或管壁聚集。因此，親水性佳的微球更容易形成均勻的混懸液，進一步表明加入10%和20%雙親含量的微球親水性佳。

4 結論

本實驗以PCL/PEG-b-PCL /氯仿為體系，研究了不同雙親含量(PEG-b-PCL)、電壓、流速對微球的形態大小及粒徑分布的影響，并研究了不同PEG-b-PCL含量對微球的親水程度影響。研究結果表明：電壓10 kV、流速為1 mL/h、雙親含量10%～20%時，能得到單分散性良好的微球；雙親含量20%時，微球表面接觸角為29.9°±4.9°，親水性較好。該研究為進一步制備載藥微球打下基礎。