異丙腎上腺素下調NADPH氧化酶負調控瘦素表達加劇db/db小鼠心功能異常

陳 鵬 王 萍

隨著現代社會生產和生活方式的改變及人口老齡化的加劇，糖尿病的發生率和死亡率呈逐年升高趨勢[1，2]。糖尿病心肌病是糖尿病最常見的并發癥，嚴重威脅患者的生存狀態和生活質量。糖尿病心肌病的發生與多種因素相關，如應激性刺激[3，4]，但是其確切的發病機制尚不明確。異丙腎上腺素是β受體激動劑，臨床上多用于支氣管哮喘和心臟房室傳導阻滯。但同時，使用異丙腎上腺素可能引起心動過速、心律失常和心悸等，甚至引起心絞痛，加劇心臟損傷，但是其確切的發病機制尚不清楚?？蒲杏?型糖尿病db/db小鼠是目前研究糖尿病發病機制及藥物治療的重要模型[5-7]。已有證據表明氧化應激與幾種心肌病動物模型有關[8-10]。本研究探討瘦素異常表達在異丙腎上腺素引起的心臟功能障礙中的作用以及NADPH氧化酶的改善作用，為相關新藥開發和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器

野生型小鼠和db/db小鼠均購自上海實驗動物中心；Anti-p22phox (sc-271968)、 Anti-p47phox (sc-365215)、Anti-p67phox (sc-374510)、Anti-gp91 (sc-130543)均購自Santa Cruz公司, Anti-基質金屬蛋白酶(MMP)2 (ab80737)、Anti-MMP9 (ab38898)、Anti-leptin (ab3583)、Anti-TIMP1/2 (ab3625) 均購自Abcam公司，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自國藥集團，NADPH氧化酶抑制劑apocynine購自Sigma Aldrich公司(粉末，純度≥98%，采用生理鹽水配置成100mg/ml實驗濃度)。脫色搖床及轉膜儀購自北京六一儀器廠；樣品保存箱和超低溫冰箱為海爾集團產品；垂直電泳儀及凝膠成像儀購自美國BioRad公司。所有操作均符合實驗動物管理條例的要求。

1.2 動物分組及處理

db/db小鼠和野生型小鼠均隨機分為3組：對照組、異丙腎上腺素組和NADPH氧化酶抑制劑apocynin組(n均=6)。異丙腎上腺素組和apocynin組小鼠給予異丙腎上腺素(1mg/kg)皮下注射，連續6天，對照組小鼠給予等量生理鹽水注射。apocynin組小鼠從第4天起給予apocynin (100mg/kg)灌胃治療，對照組和異丙腎上腺素組小鼠給予等劑量的CMC-Na (100mg/kg)灌胃。6天后檢測以下指標。

1.3 小鼠心功能指標檢測

主要計算左心室重量指數，連續測出3個心搏舒張末左室內徑、舒張末室間隔厚度、左室后壁厚度，得出平均值，然后采用Deiereux的心室重量校正公式校正左心室重量，再進一步計算左心室重量指數。

1.4 Western Blotting檢測NADPH 氧化酶亞基、瘦素及MMP和TIMP1/2蛋白表達

小鼠腹腔注射20%烏拉坦(0.5ml/100g)進行麻醉，脫臼處死并分離心臟組織。提取小鼠左心室總蛋白，采用考馬斯亮藍法進行總蛋白的定量。在各個點樣孔中以等量蛋白進行10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳和半干法進行轉膜。然后將醋酸纖維素膜用5.0%的脫脂牛奶封閉1h。纖維素膜封閉后與一抗4℃雜交過夜，無菌PBS漂洗3次后與辣根過氧化酶標記二抗室溫反應后進行顯色、拍照。用凝膠成像分析系統測定光密度，以β-actin為內參進行蛋白的相對定量分析。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 apocynine改善異丙腎上腺素引起的左心室異常

不論是野生型小鼠還是db/db型小鼠，多組間左心室重量指數差異均有統計學意義(F=32.545，46.587，P<0.01)，與同型小鼠對照組比較，異丙腎上腺素組小鼠左心室重量指數均明顯升高(t=1.435，2.433，P<0.01)，而apocynine組較異丙腎上腺組明顯改善(t=2.453,2.067，P<0.05)，見圖1。

注：與對照組比較，*P< 0.01；與異丙腎上腺組比較，#P< 0.01；與同組野生型小鼠比較，△P<0.05

2.2 apocynine改善異丙腎上腺素引起瘦素蛋白的異常表達

不論是野生型小鼠還是db/db小鼠，多組間瘦素蛋白的表達差異均有統計學意義(F=32.765，49.023，P<0.01)，與同型對照組小鼠比較，異丙腎上腺素引起野生型和db/db型小鼠瘦素表達顯著降低(t>4.435，P<0.01)，而apocynin組小鼠上述異常明顯恢復(P<0.01)，見圖2。

注：與對照組比較，*P< 0.01；與異丙腎上腺組比較，#P< 0.01；與同組野生型小鼠比較，△P<0.05

2.3 apocynine改善異丙腎上腺素引起的NADPH 氧化酶亞基異常表達

不論是野生型小鼠還是db/db型小鼠，多組間NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phoox、p67phox和 gp91差異均有統計學意義(F均>29.753，P<0.01)。與對照組比較，異丙腎上腺素組小鼠NADPH 氧化酶亞基p22phox、p47phoox、p67phox和 gp91表達顯著升高(t均>2.234，P<0.01)，而apocynine組較異丙腎上腺組明顯改善(t均>2.450,P<0.01)，見圖3。

注：與對照組比較，*P<0.01；與異丙腎上腺組比較，#P<0.01；與同組野生型小鼠比較，△P<0.05

2.4 apocynine改善異丙腎上腺素引起的MMP異常表達

不論是野生型小鼠還是db/db型小鼠，多組間MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2表達差異均有統計學意義(F均>34.341，P<0.01)。與對照組比較，異丙腎上腺素組小鼠MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2表達顯著升高(t均>3.398，P<0.01)，而apocynine組較異丙腎上腺組明顯改善(t均>4.185，P<0.01)，見圖4。

注：與對照組比較，*P<0.01；與異丙腎上腺組比較，#P<0.01；與同組野生型小鼠比較，△P<0.01

3 討 論

糖尿病心肌病是糖尿病最常見的大血管并發癥之一，嚴重威脅著患者的生存狀態。但目前關于糖尿病心肌病的發病機制尚不明確。β受體的激活參與了心律失常的惡化及心臟功能的異常過程。本研究發現異丙腎上腺素組小鼠存在明顯的心功能異常，且NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox及瘦素表達明顯升高，MMP2/9和TIMP1/2也明顯升高，且db/db小鼠變化比野生型小鼠變化明顯，表明異丙腎上腺素通過下調NADPH氧化酶負調控的瘦素表達加劇db/db小鼠心肌功能異常。

以往的研究發現MMPs及其抑制劑調控了心肌纖維化及糖尿病并發癥和心律失常的病理過程[11，12]。MMPs的異常表達導致了心臟結構的異常和心肌細胞內電信號轉導的異常[13，14]。本研究中也證實了MMPs和TIMPs蛋白表達的異常是異丙腎上腺素引起心肌細胞損傷的重要機制。膠原的積聚過程和MMP表達的升高與多種因素相關[15-17]。氧化應激過程是細胞內最常見的病理及生理過程，且與多種疾病的發病密切相關，如糖尿病、心肌病等。本研究也發現異丙腎上腺素能夠引起NADPH 氧化酶亞基表達的顯著增強，而apocynine可以有效緩解上述異常，提示NADPH氧化酶調控的氧化應激也與此過程有關。

基于上述結果，本研究推斷異丙腎上腺素惡化db/db小鼠的心功能的過程中NADPH氧化酶發揮著關鍵的作用，而apocynine是NADPH氧化酶的特異性抑制劑，能夠直接與NADPH氧化酶結合而發揮作用，本研究中apocynine為陽性對照藥物，其可以通過抑制NADPH氧化酶改善小鼠心功能異常。在多種心肌病病理模型中，MMP及其抑制劑調控的細胞外基質重構發揮著重要的作用[18，19]。以往的研究發現細胞外基質的降解與重構是心臟、腎臟等器官發生組織纖維化的重要誘因[20，21]。本研究也證實與對照組比較，異丙腎上腺素組小鼠心功能存在明顯的異常，且NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox及瘦素表達明顯升高，MMP2/9和TIMP1/2也明顯升高。

綜上所述，本文通過分析推測異丙腎上腺素通過下調NADPH氧化酶負調控的瘦素表達加劇db/db小鼠心肌功能異常，其具體機制有待進一步研究。