化學誘變劑EMS對知母種子萌發的影響

楊 楠 聶江力 辛 微 夏 徐 郎玉潔 裴 毅

(天津農學院園藝園林學院，天津 300384)

知母(Anemarrhenaasphodeloides)為百合科(Liliaceae)知母屬(Anemarrhena)多年生草本植物，其干燥根莖可入藥，有清熱瀉火，生津潤燥的藥用功效[1]。知母中含有皂苷類、雙苯吡酮類等多種有效成分，在抗老年性癡呆，研究抗癌藥物或先導化合物等方面具有較高的研究價值和良好的開發前景[2]。知母的耐鹽堿能力較強，目前在天津也已經試種成功，但知母植株較高，種植凌亂，且品種混亂，質量較差，產量較低，所以需要在原有種質資源的基礎上選育性狀更加優良的新品種。

誘變可使植物形成自然界沒有的或常規方法較難獲得的新性狀和新基因，同時還避免了轉基因在安全和后代穩定性上的問題。在眾多化學誘變試劑中，甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)是目前作物誘變育種中應用最廣泛、效果最好的化學誘變劑之一[3～4]。其原因是利用EMS誘變技術創制突變體，容易形成點突變，但又不會造成染色體畸變[5]。我國化學誘變育種起步較早，已經取得了令世人矚目的成就，誘變育成的品種數量和種植面積也居世界第一[6]。目前，很多學者在水稻[7]、擬南芥[8]、大麻[9]和西葫蘆[10]等植物上做了深入的EMS誘變技術的研究，陳紹江等[11]利用EMS誘變處理玉米花粉，獲得了玉米的高油突變體。

目前，國內關于知母的研究主要集中在其活性成分和藥用效果，針對優良知母品系的誘變育種的研究較少。有學者利用我國發射的神舟三號宇宙飛船搭載知母種子進行航天誘變，回收繁殖后發現知母中的微量元素指標明顯優化[12]，但航天誘變不易普及。因此，本試驗用不同濃度EMS處理知母種子，確定知母種子誘變的適宜EMS濃度和處理時間，為創新種質資源、選育知母新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

知母(A.asphodeloides)種子采收自天津市薊州區翠屏湖科學園中藥種植基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理與發芽實驗

選取完整、飽滿的知母種子，用高錳酸鉀溶液浸泡30 min進行消毒除菌。EMS溶液用0.01 mol·L-1(pH=7.0)的磷酸緩沖液配制，設置5個濃度(V/V)，分別是0%、1%、2%、4%、6%，每個濃度分別浸種6、8、12、24 h，每組處理3次重復，處理后的種子用流水沖洗2 h，然后置鋪有2層濾紙的培養皿中，于25℃恒溫培養箱中進行發芽試驗。

1.2.2 發芽指標與數據處理

計算發芽率、相對發芽率和相對致死率等指標，各指標計算方法如下：

發芽率(%)=9d內正常萌發種子數/種子總數×100%

(1)

相對發芽率(%)=各EMS濃度誘變處理組的發芽率/對照組的發芽率×100%

(2)

相對致死率(%)=(對照組發芽率-各處理組的發芽率)/對照組的發芽率×100%

(3)

試驗數據用Excel進行統計處理，用SPSS22.0對計算結果進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度EMS誘變處理6 h對知母種子萌發的影響

不同EMS濃度誘變處理知母種子6 h后置恒溫培養箱發芽第9天的發芽率、相對發芽率、相對致死率見表1。隨著EMS濃度的增加，知母種子的發芽率、相對發芽率呈下降趨勢，相對致死率逐漸上升。濃度2%處理下，第9天的發芽率57.8%，相對發芽率85.2%，低于對照組，4%濃度EMS誘變處理組發芽率54.4%，顯著低于對照組，6%濃度EMS誘變處理組發芽率為48.9%，低于對照組，差異極顯著。

表1不同濃度EMS誘變處理6h對知母種子萌發的影響

Table1EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor6honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS濃度EMS concentration(%)發芽率Germination rate(%)相對發芽率Relative germination rate(%)相對致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.01abAB1000170.0±3.33aA103.3-3.30257.8±3.85bcAB85.214.75454.4±3.85cBC80.319.67648.9±7.69cC72.127.87

由圖1可知，不同濃度EMS誘變處理6 h的知母種子從第2天開始有發芽，對照組第5天的發芽率為47.8%，濃度2%、4%、6%誘變處理組第5天的發芽率分別為41.1%、38.9%、41.1%。對照組在第5天后，日發芽數逐漸減少，第7天后不再新增發芽。除濃度1%處理組在第9天發芽率高于對照組之外，其余處理組在第5天之后的發芽率均低于對照組。

2.2 不同濃度EMS誘變處理8 h對知母種子萌發的影響

不同EMS濃度誘變處理知母種子8 h后，置恒溫培養箱發芽試驗。隨著EMS濃度的增加，知母種子的發芽率、相對發芽率逐漸降低，相對致死率逐漸升高(表2)。2%濃度EMS誘變處理組在第9天的發芽率54.4%，相對發芽率80.3%，低于對照組；4%濃度EMS誘變處理組發芽率為53.3%，顯著低于對照組，6%濃度EMS誘變處理組發芽率為44.4%，低于對照組，差異顯著。

表2不同濃度EMS誘變處理8h對知母種子萌發的影響

Table2EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor8honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS濃度EMS concentration(%)發芽率Germination rate(%)相對發芽率Relative germination rate(%)相對致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.0aA1000157.8±13.5abA85.214.8254.4±11.7abA80.319.7453.3±8.8abA78.721.341644.4±10.7bA65.634.4

由圖2可知，1%和4%濃度處理在第2天開始發芽，2%、6%和對照組在第3天開始發芽，對照組在第5天的發芽率為42.2%，濃度2%、4%、6%誘變處理組第5天的發芽率分別為33.3%、31.1%、23.3%。對照組和各處理組在第5天日發芽數最高，第5天后，日發芽數逐漸減少，第7天后不再新增發芽。各處理組在第5天之后的發芽率均低于對照組。

圖2 不同濃度EMS處理知母種子8 h后種子累計發芽曲線Fig.2 Cumulative germination curve of A.asphodeloides seed after 8 h treatment with different concentrations of EMS

2.3 不同濃度EMS誘變處理12 h對知母種子萌發的影響

不同EMS濃度誘變處理知母種子12 h，置恒溫培養箱發芽第9天的發芽率、相對發芽率、相對致死率見表3。隨著EMS濃度的增加，知母種子的發芽率、相對發芽率逐漸降低，相對致死率逐漸上升。2%濃度EMS誘變處理組在第9天的發芽率56.7%，相對發芽率83.6%，低于對照組；4%濃度EMS誘變處理組發芽率為52.2%，低于對照組，差異顯著；6%濃度EMS誘變處理組發芽率為36.7%，低于對照組，差異極顯著。

由圖3可知，對照組和6%濃度處理在第2天開始發芽，1%、2%、4%濃度處理組在第3天開始發芽，對照組在第5天的發芽率為55.6%，濃度2%、4%、6%誘變處理組第5天的發芽率分別為32.2%、26.7%、23.3%。對照組和各處理組在第5天日發芽數最高，第5天后，日發芽數逐漸減少，第7天后不再新增發芽。各處理組在第5天之后的發芽率均低于對照組。

表3不同濃度EMS誘變處理12h對知母種子萌發的影響

Table3EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor12honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS濃度EMS concentration(%)發芽率Germination rate(%)相對發芽率Relative germination rate(%)相對致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.0aA1000163.3±5.8abA93.46.6256.7±3.3abAB83.616.4452.2±4.0bAB77.023.0636.7±8.8cB54.145.9

圖3 不同濃度EMS處理知母種子12 h后種子累計發芽曲線Fig.3 Cumulative germination curve of A.asphodeloides seed after 12 h treatment with different concentrations of EMS

2.4 不同濃度EMS誘變處理24 h對知母種子萌發的影響

不同EMS濃度誘變處理知母種子24 h，置恒溫培養箱發芽第9天的發芽率、相對發芽率、相對致死率見表4。隨著EMS濃度的增加，知母種子的發芽率、相對發芽率逐漸降低，相對致死率逐漸上升。2%濃度EMS誘變處理組在第9天的發芽率61.1%，相對發芽率90.2%，低于對照組；4%濃度EMS誘變處理組發芽率為44.4%，低于對照組，差異極顯著；6%濃度EMS誘變處理組發芽率為38.9%，低于對照組，差異極顯著。

表4不同濃度EMS誘變處理24h對知母種子萌發的影響

Table4EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor24honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS濃度EMS concentration(%)發芽率Germination rate(%)相對發芽率Relative germination rate(%)相對致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.0aA1000161.1±2.9aAB90.29.8261.1±5.9aAB90.29.8444.4±2.2bBC65.634.4638.9±4.4bC57.442.6

圖4 不同濃度EMS處理知母種子24 h后種子累計發芽曲線Fig.4 Cumulative germination curve of A.asphodeloides seed after 24 h treatment with different concentrations of EMS

由圖4可知，不同濃度EMS誘變處理24 h的知母種子從第2天開始有發芽，對照組第5天的發芽率為48.9%，濃度2%、4%、6%誘變處理組第5天的發芽率分別為45.6%、31.1%、23.3%。對照組在第5天后，日發芽數逐漸減少，第7天后不再新增發芽。各處理組在第5天之后的發芽率均低于對照組。

2.5 不同濃度EMS誘變對知母種子萌發的影響

由圖5可見，隨EMS濃度增加，種子發芽率呈現逐漸增加的趨勢。當處理時間為6 h時，發芽率較高的是1%和對照組，且1%處理下種子發芽率高于對照組，在70%以上，其次是濃度2%、4%和6%處理，發芽率均在60以下，且與對照組差異顯著，發芽率最低的濃度6%處理組(48.67%)較發芽率最高的1%處理組(70.33%)降低了21.66%。當處理時間為8 h時，濃度1%處理的發芽率降低到57.67%，較6 h時的濃度1%處理發芽率降低了12.66%。濃度2%、4%和6%處理下的發芽率也有所降低，但變化幅度較小。當處理時間為12 h時，濃度1%處理下發芽率(73.00%)高于對照組，為所有處理組的最高值。其余濃度處理組的發芽率均降低。當處理時間為24 h時，濃度1%處理的發芽率高于8 h處理，濃度2%處理的發芽率高于其他處理時間，濃度6%處理的發芽率高于12 h處理。

圖5 不同濃度EMS對知母種子發芽率的影響Fig.5 The effect of different EMS concentration on germination rate of A.asphodeloides seeds

從表5可知，不同濃度EMS處理對知母種子發芽率影響極顯著，P<0.01，處理時長則不是影響知母種子萌發的主體因素，同時EMS濃度和處理時長的交互作用對知母種子萌發的影響較小。

表5不同濃度和時間處理下知母種子發芽率的方差分析表

Table5VarianceanalysisofgerminationrateofA.asphodeloidesseedsunderdifferentconcentrationsandtimetreatments

來源Source平方和SSType Ⅲ Sum of Squaresdf均方S2Mean SquareFP濃度Concentration5810.13941452.53512.8690.000 時間Time557.5113185.8371.6460.190 濃度/時間Concentration/time1368.84512114.0701.0140.455 誤差Error5869.37152112.873

3 討論

利用化學誘變育種已在植物研究領域中被廣泛研究和利用，選擇適宜的誘變劑對于獲得理想性狀是十分重要的。EMS是一種通過直接修飾堿基的化學結構而改變DNA性質的穩定、高效的誘變劑[13]，具有誘變效率高、范圍廣、頻率高等優點，已在大田作物突變體庫構建和種質創新中得到廣泛應用[14]。

進行誘變育種研究的關鍵是確定最佳的誘變條件，通常以半致死濃度為最適宜誘變條件[15]。誘變條件的選擇與種子的大小，種皮的透水性等因素相關。如種子較小的十字花科植物油菜[16]、大白菜[4]的種子的最佳誘變濃度和時間分別為0.2% 8 h和0.4%～0.6% 4 h，豆科牧草紫花苜蓿種子[17]的最佳誘變濃度為1.6% 8 h。種子的發芽率是良好的種子活力的測定指標，有學者設置4個EMS濃度(0%，1%，2%，3%，4%)分別處理加工番茄干種子0、6和12 h，結果表明，4%濃度處理12 h時，干番茄種子發芽率接近半致死劑量[18]。本試驗將濃度設置為1%、2%、4%和6%，時間設置為6、8、12和24 h，與前人設置的濃度和時間有所不同。通過對知母種子發芽效果進行分析，結果表明處理時間為6和8 h時，知母種子發芽率隨EMS濃度增加而減小，且4%濃度EMS處理下，發芽率接近50%，接近半致死劑量；當處理時間為12和24 h，2%和4%濃度處理下發芽率接近50%，濃度增加到6%時，發芽率為36.67%，顯著低于對照組，表明6%EMS處理對種子萌發損傷較大。

4 結論

知母是一種常用的中藥材，對人體的中樞神經系統、免疫系統和運動系統有顯著的藥理作用。本研究通過設定4個濃度梯度和4個時間梯度對知母種子進行處理，結果表明EMS濃度為4%，處理時間為12和24 h時，發芽率比較接近50%，接近半致死劑量，確定適宜條件是濃度為4%，浸種12和24 h。通過濃度梯度和時間梯度篩選出用于EMS處理知母種子的最佳濃度和時間，為后續構建知母誘變群體，篩選品質優化的知母新品種奠定基礎。