人微小纖溶酶原cDNA在畢赤酵母中的高效表達及活性檢測

王 娜，何成霞，鄒 強，茍興華，陳 松，吳昊俁，蔡心析，許天恒

(成都大學，四川 成都 610106)

【研究意義】人纖溶酶原由791個氨基酸被分子內24個二硫鍵折疊形成多結構域的糖蛋白，其分子量約92～94 kDa。人纖溶酶原包含3個結構域：N端肽鏈、五環結構域和絲氨酸活性中心[1]。人纖溶酶原是絲氨酸類酶人纖溶酶的前體，主要在肝臟中合成，進而分泌到血液和細胞外液中[2]。人纖溶酶原的激活是纖溶級聯的中心事件，纖溶酶原被激活劑高效切割R561～V562的肽鍵激活形成纖溶酶，該物質可以分解體內的血塊[3]。纖溶酶還在金屬蛋白酶激活、傷口的愈合、器官移植、血管再生術、病原體和腫瘤細胞的侵襲等反應中發揮重要的作用[4-8]。人纖溶酶原是一條氨基酸鏈組成而人纖溶酶是由兩條鏈組成；重鏈包含N端肽鏈、五環結構域，輕鏈包含絲氨酸活性中心[9]。人微小纖溶酶原不僅分子量小、擴散快、易于大批制備、可長期貯存，并可避免交叉污染，對于眼科疾病及其并發癥的治療有很好的效果?！厩叭搜芯窟M展】尿激酶和葡激酶都可以作為纖溶酶原激活劑，這些激活劑本身就可以作為治療溶栓障礙的藥物[10]。而纖溶酶治療血栓疾病的效果最好。近期發現纖溶酶原在治療人玻璃體后脫落有很大的效果。由于栓塞局部血流阻斷，纖溶酶原不能持續補充，所以效率不高。如果注射人微小纖溶酶原到視網膜靜脈，可以使靜脈血栓溶解，血管再通，而達到治療效果?！颈狙芯壳腥朦c】本文中通過去除人纖溶酶原的N端多肽及5個三角區，形成的人微小纖溶酶原是PlgC端549～790位間的241個氨基酸殘基組成的肽鏈(包含絲氨酸蛋白酶結構域)，分子量約29 kDa，有6對二硫鍵，沒有PlgN端5個三角區，但是被激活后能夠形成具有纖溶活性的mplm。由于人微小纖溶酶原含有二硫鍵，在大腸桿菌中翻譯后，不能進一步加工折疊，分離純化后需要對人微小纖溶酶原進行復性，最高復性率為50 %，該過程繁瑣且具有不定性，而在動物細胞中表達成本非常高?！緮M解決的關鍵問題】本文選擇pPICZαA作為載體，其含有α-factor可以將人微小纖溶酶原分泌至胞外，用畢赤酵母作為宿主菌可以對人微小纖溶酶原進行正常折疊。甲醇誘導人微小纖溶酶原的表達，從而實現人微小纖溶酶原在畢赤酵母中的高效表達，為眼科疾病治療的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒E.coliJM109、pPICZαA、PichiaSMD1168。

1.1.2 重組質粒構建及相關試劑耗材 限制性內切酶XhoI和NotI，SacI, ligation試劑盒，PCR片段純化試劑盒均購置于Takara；氨芐青霉素和博來霉素；質粒DNA小抽試劑盒購置于QIAUGEN。其它化學試劑均為國產試劑。

1.1.3 主要儀器和設備 DNA電泳儀、PCR儀、超凈工作臺、離心機、恒溫培養箱、溫控搖床、蛋白電泳系統、脫色搖床、恒溫金屬浴鍋和紫外分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 人微小纖溶酶原基因序列的設計及擴增 從NCBI數據庫中調取已知人微小纖溶酶原氨基酸序列，然后通過Sequence Quickie-Calc軟件根據畢赤酵母密碼偏愛性獲得人微小纖溶酶原的基因序列并在兩端加入NotI和XhoⅠ內切酶識別的基因序列，然后委托生物工程公司合成。

1.2.2 人微小纖溶酶原基因與pPICZαA質粒的連接 培養含有pPICZαA的E.coliJM109到對數生長期時提取質粒，用限制酶NotⅠ和XhoⅠ雙酶切分別處理pPICZαA和mPlg基因后純化，用DNA連接酶連接形成pPICZαA-mPlg后轉化至E.coliJM109。篩選重組子，提取陽性轉化菌的質粒，直接用BglⅡ37 ℃，1 h，酶切之后跑核酸電泳看其核酸片段大小是否符合要求。

1.2.3 重組質粒pPICZαA-mPlg的擴增及構建多拷貝 取單菌落的E.coliJM109將其接種到LB培養基中進行活化至對數生長期，用化學法提取重組質粒pPICZαA-mPlg。用BglⅡ和BamHⅠ雙酶切重組質粒，獲得包含AOX1啟動子、α信號肽和微小纖溶酶原基因的片段，同時BamHⅠ處理含有目的基因的重組質粒，用連接酶將含有目的基因元件連接到線性化的重組質粒中，最后用BglⅡ和BamHⅠ來消除頭頭相連和尾尾相連的多拷貝，依次重復兩次以上操作，獲得4拷貝的pPICZαA-mPlg重組質粒。然后用bstXⅠ酶切重組的多拷貝質粒，苯酚-氯仿溶液沉淀蛋白，之后用3M的CH3COONa、無水乙醇濃縮多拷貝pPICZαA-mPlg。同時用0 ℃無菌1M的山梨醇和無菌水制備感受態畢赤酵母。

1.2.4 人微小纖溶酶原基因在畢赤酵母中的表達 使用電轉化將重組質粒導入感受態畢赤酵母中，在含有博來霉素的YPDS中培養，用菌落PCR鑒定陽性重組子，將其命名為PCP4PLG。然后把PCP4PLG接種到 BMGY培養基中，培養至OD600在2～5之間時加入終濃度為0.5 %的無水甲醇，繼續培養72 h，每24 h取菌液，2000 r/min離心，取適量上清液跑十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，鑒定是否有目的蛋白的表達。

1.2.5 人微小纖溶酶原的活性檢測 使用發色底物法S-2403(pyroGlu-Phe-Lys-pNA·HCl)在波長為405 nm處檢測發色底物S-2403的吸光度，從而達到檢測人微小纖溶酶原的活性效果，將甲醇誘導4 d后的畢赤酵母菌液離心獲得的上清液作為樣品，長白山白眉蝮蛇蛇毒中提取的蛋白分解酶為標品，尿激酶作為人微小纖溶酶原激活劑，50 mM Tris-HCl pH7.4作為緩沖液，37 ℃在96孔板中反應。S-2403使用的濃度是0.3 mM，人微小纖溶酶原的檢測終濃度在1～10 nM。

圖1 人微小纖溶酶原多拷貝基因構建Fig.1 Constructing the mutiple copy expression vectors

1.2.6 甲醇添加比對人微小纖溶酶原表達的影響 選取上述實驗得到最高活性的PCP4PLG，將其接種至BMGY培養基中，待其生長至對數生長期，以0.25 %、0.5 %、1 %、2 %、4 %的甲醇終濃度進行誘導培養，每培養24 h分別加入同樣量的甲醇，連續培養4 d后收集發酵液，取1 mL發酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結果得到甲醇的最適添加比。

1.2.7 pH對人微小纖溶酶原表達的影響 配制磷酸鉀緩沖液pH梯度為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的BMGY培養基，將工程菌接種至培養基中，待其生長至對數生長期，加入上述實驗得到的最佳甲醇添加比的甲醇溶液進行誘導培養，連續培養4 d后收集發酵液，取1 mL發酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結果得到最適pH值。

1.2.8 溫度對人微小纖溶酶原表達的影響 選取上述實驗得到最高活性的PCP4PLG，將其接種至BMGY培養基中，待其生長至對數生長期后加入甲醇，然后在溫度梯度為25、30、35 ℃的搖床恒溫培養箱中培養。培養6 d后收獲發酵液，取1 mL發酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結果得到最佳培養溫度。

1.2.9 溶氧量對人微小纖溶酶原表達的影響 選取上述實驗得到最高活性的PCP4PLG，將其接種至BMGY培養基中，待其生長至對數生長期后加入甲醇，然后在150、200、250、300 r/min 的搖床恒溫培養箱中培養。培養6 d后收獲發酵液，取1 mL發酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結果得到最佳搖床轉速。

1.2.10 發酵周期對人微小纖溶酶原表達的影響 選取上述實驗得到最高活性的PCP4PLG，將其接種至BMGY培養基中，待其生長至對數生長期加入無水甲醇然后分別在誘導1、2、3、4、5、6 d收集發酵液，取1 mL發酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結果得到最佳發酵周期。

1.2.11 純化 將工程菌在上述得到的最佳發酵條件中培養并收集，將發酵液在4 ℃、8000 r/min進行離心10 min。然后收集上清液用3 kDa超濾膜進行濃縮，使其體積為原來的1/10。SP-Sepharose FF 層析柱進行平衡，平衡時用pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液，然后將超濾濃縮的發酵液用pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液稀釋3倍后上樣。將上述溶液上樣后，用pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液沖洗柱子到第1個峰結束。再用pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液和pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液含1 mol/L的NaCl溶液進行洗脫。將收集的各組分跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性。

2 結果與分析

2.1 人微小纖溶酶原基因與pPICZαA質粒的連接后用BglⅡ酶切

pPICZαA-mPlg質粒被BglⅡ酶切后，1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析產物，人微小纖溶酶原基因為700 bp左右，pPICZαA為3.6 kb，重組的pPICZαA-mPlg為4.3 kb。在電泳膠上顯示有4000 bp多的電泳條帶，實驗結果與預測結果一致，表明質粒構建成功(圖2)。

康熙十四年十月十三日，幸盤山諸寺，皆賜金。 智樸和尚呈《接駕詩二首》?？滴醵迥晔乱蝗?，康熙再次幸臨盤山盤谷寺，賜詩，智樸作《丙寅季冬一日駕幸青溝應制詩》如下：

2.2 多拷貝載體雙酶切后核酸電泳結果

pPICZαA-4mPlg被BglⅡ和BamHⅠ雙酶切后，1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析產物。一個人微小纖溶酶原的表達元件是2436 bp，4拷貝的人微小纖溶酶原為9744 bp。1～4號樣品中，都有一條接近10 000 bp的4拷貝條帶和3.6 kb的載體條帶。實驗結果與預測結果一致，表明質粒構建成功(圖3)。

M: DNA marker DL10000;1：pPICZαA-mPlg digested with BglⅡ圖2 重組蛋白表達載體構建Fig.2 Construction of expression vector of the recombinant protein

M:DNA marker DL10000; 1～4：BglⅡ和BamHⅠ雙酶切后的4拷貝重組蛋白表達載體圖3 4拷貝重組蛋白表達載體構建Fig.3 Construction of 4 copys expression cassette vector of the recombinant protein

2.3 轉化到酵母中的菌落PCR鑒定

pPICZαA-4mPlg轉化到酵母后，1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。從圖4可知，1、3、4、6-15都有條帶，2號為pPICZαA所 PCR的產物，1號為pPICZαA-4mPlg的PCR產物，除5號其他樣品跑出來的電泳條帶均與1號相同為1400 bp，實驗結果與預測結果一致，轉化成功。

2.4 SDS-PAGE電泳結果

12 %SDS-PAGE電泳結果顯示，1～7號泳道可見相對分子質量為29 kDa，1～6號泳道為4拷貝表達載體轉化子；7號泳道為單拷貝表達載體轉化子；8號泳道為不含人微小纖溶酶原基因但是有pPICZαA 的畢赤酵母，9號泳道為1號樣品加入甲醇誘導劑之前的菌液。8、9泳道在29 kDa都沒有條帶，1～7號泳道畢赤酵母在加入甲醇溶液后，都產生人微小纖溶酶原大小的目的蛋白大小與預期相符合，且單拷貝蛋白電泳條帶明顯比多拷貝電泳條帶淡很多，說明多拷貝表達量高。

2.5 發酵周期對人微小纖溶酶原產量的影響

從圖6和7可知，PCP4PLG被甲醇誘導1～6 d內蛋白表達量隨著時間的增加而增加，當甲醇誘導6 d后人微小纖溶酶原的產量最高。

M:DNA marker DL10000;1～14:pPICZαA-4mPlg轉化到酵母后的PCR產物,15:4拷貝表達質粒載體的PCR產物圖4 菌落PCR篩選陽性克隆Fig.4 PCR screening positive clone

M:Protein marker;1～6：4拷貝表達載體轉化子; 7：單拷貝表達載體轉化子; 8：含pPICZαA 的畢赤酵母; 9：誘導前樣品圖5 培養基上清液目標蛋白蛋白質電泳結果Fig.5 SDS-PAGE peofile of expressed protein

1：誘導前;2：不含目的基因酵母誘導6D;3：誘導1D;4：誘導2D;5：誘導3D;6：誘導4D;7：誘導5D;8：誘導6D圖6 1 %甲醇不同誘導時間對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.6 Effect of different induction time of 1 % methanol on expressing the microplasminogen

圖7 誘導天數對人微小纖溶酶原活性的影響Fig.7 Effect of induction days on microplasminogen activity

1：0.25 %甲醇;2：0.5 %甲醇;3：1 %甲醇;4：2 %甲醇;5：3 %甲醇;6：誘導前圖8 誘導劑濃度對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.8 Effect of different induction concentration of methanol on expressing the microplasminogen

2.6 誘導劑濃度對人微小纖溶酶原產量的影響

從圖8～9可知，PCP4PLG被不同濃度甲醇持續誘導4 d后的電泳結果和活性檢測顯示。甲醇終濃度為2 %，產量最高，活性最高。

2.7 pH對人微小纖溶酶原產量的影響

從圖10～11可知，PCP4PLG在磷酸鉀緩沖液pH為3 、4、5、6、7中被甲醇誘導4 d后的發酵樣品。pH為7時，活性最高。

圖9 甲醇終濃度對人微小纖溶酶原活性的影響Fig.9 Effect of final concentration of methanol on microplasminogen activity

1：pH3；2：pH4；3：pH5；4：pH6；5：pH7；6：pH6不含目的基因酵母；8：誘導前圖10 pH對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.10 Effect of different pH on expression the microplasminogen

圖11 pH對活性的影響Fig.11 Effect of pH on microplasminogen activity

2.8 不同OD600誘導對人微小纖溶酶原產量的影響

1: OD600 =2;2: OD600 =3;3: OD600 =5;4:OD600 =6;5:OD600 =8;6: OD600 =10;7: OD600 =12;8: 誘導前;9:不含目的基因酵母OD600圖12 不同OD600添加甲醇對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.12 Effect of different OD600 add methanol on expressing the microplasminogen

圖13 OD600對活性的影響Fig.13 Effect of OD600 on activity

1: r/min=150;2: r/min=175;3: r/min=200;4:r/min=225;5:r/min=250;6: r/min=275;7: r/min=300;8: 誘導前;9:不含目的基因酵母r/min=250圖14 不同轉速對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.14 Effect of different rooting speed on expression the microplasminogen

2.9 溶氧量對人微小纖溶酶原產量的影響

PCP4PLG在不同轉速下甲醇誘導4 d后的發酵樣品。由圖14～15可知，人微小纖溶酶原的產量隨溶氧量的增高而增強?？紤]到發酵容器的容量有限，若是轉速越高，容器內的發酵液所受到離心力越大而導致發酵液容易飛濺或污染。所以僅考慮250 r/min為最適溶氧量。

圖15 轉速對活性的影響Fig.15 Effect of rooting speed on microplasminogen activity

1:r/min=24 ℃;2:r/min=26 ℃ 3: r/min=28 ℃;4:r/min=30 ℃;5:r/min=32 ℃;6: r/min=34 ℃;7: r/min=36 ℃;8: 誘導前;9:不含目的基因酵母30 ℃圖16 不同溫度對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.16 Effect of different temperature on expression the microplasminogen

圖17 溫度對活性的影響Fig.17 Effect oftemperature on microplasminogen activity

2.10 溫度對人微小纖溶酶原產量的影響

PCP4PLG在不同溫度下甲醇誘導4 d后的發酵樣品。由圖16～17可知，PCP4PLG在30 ℃表達人微小纖溶酶原產量最佳。

表1 樣品稀釋80倍組吸光度與活性濃度

2.11 蛋白純化SDS-PAGE及活性檢測

由表1和圖18可知，峰內和洗脫液在29 kDa有很明顯的電泳條帶，在峰內的樣品和洗脫液都有活性，代表人微小纖溶酶原純化成功，蛋白的純度接近90 %，且測得的活性高達336 U/mL且蛋白回收率為69 %。

3 結 論

國內的沈俊卿等[11]表達Plg C 端530～790位間的261個氨基酸殘基組成的肽鏈，在大腸桿菌中表達。由于大腸桿菌在蛋白翻譯后不能對纖溶酶原進行正常折疊，需要體外用半胱氨酸復性但是體外復性可能形成錯誤折疊，得到有活性的人微小纖溶酶原含量很不理想，而且耗時很長。宋鋼等[12]在畢赤酵母中成功表達含有261個氨基酸的人微小纖溶酶原且有活性，但沒有具體說明其產量。Rongzeng Liu[13]在畢赤酵母中成功表達出含有261個氨基酸序列的人微小纖溶酶原，在5 L的發酵罐中，超過40h的誘導酵母分泌的蛋白含量達到1.88 g/L，上清液的活性單位達到7.9 U/mL。國外的Kishore k等[14]，成功表達在信號肽的作用下從畢赤酵母中分泌出來的不含五環結構的人微小纖溶酶原，并測定其活性、氨基酸序列等。Frans Aerts等[15]，在畢赤酵母中表達人纖溶酶原C端249個氨基酸序列，并用豬眼睛做實驗測定其水解層粘蛋白、纖維連接蛋白的活性。

研究人微小纖溶酶原為未來研究其結構和機制提供條件。通過發酵條件優化得到PCP4PLG的最適pH值為7，最適溫度為30 ℃和最佳甲醇添加比為2 %，搖床轉速在250 r/min，在酵母生長濃度為1時添加甲醇持續誘導6 d，畢赤酵母表達人微小纖溶酶原的產量最高且發酵液活性為90 U/mL，進行SP-Sepharose fast flow凝膠層析后的蛋白液活性為336 U/mL，為后續進行大規模表達人微小纖溶酶原打下了基礎。

4 討 論

不同物種對遺傳密碼子具有一定的偏好性，當酵母表達非自身基因時，某些稀有密碼子的出現可能限制細胞中氨酰tRNA對氨基酸的正常運轉而導致翻譯的提前終止，此外，不恰當的 AT 比例及分布也會明顯降低表達水平[16]。因此，找到人微小纖溶酶原的氨基酸序列，需要通過軟件設計畢赤酵母偏愛的人微小纖溶酶原的cDNA序列。

1: 峰內;2: 峰內;3: 穿透液;4:洗脫液;5:發酵液 圖18 不同純化階段的人微小纖溶酶原含量Fig.18 Human microplasminogen content in different purification stages

畢赤酵母SMD1168為甲醇快利用型菌株，其同時含有編碼醇氧化酶AOX1 和 AOX2 基因。一般情況下，分泌蛋白表達選擇AOX1為啟動子，其表達出來的蛋白活性相對于AOX2為啟動子的要高一些[17]。而且畢赤酵母SMD1168為組氨酸脫氫酶缺陷菌株，可以利用組氨酸來篩選重組子。蛋白酶缺陷型的宿主菌蛋白含量少，可以減少目的蛋白的降解[18]。

載體選用pPICZɑA，其中含有在大腸桿菌可以擴增的原核啟動子，同時含有5’AOX1 啟動子、3’AOX1終止子。多克隆位點、抗性篩選標計、線性化酶切位點、C 末端聚組氨酸標簽，以便于外源基因通過質粒整合到酵母基因組并進行篩選、表達，也有利于外源蛋白的檢測和純化[19]。

人微小纖溶酶原的表達及活性鑒定。在重組子被篩選出來后，酵母不需要很細化的培養基成分只需要用BMGY培養基就可以來培養及誘導人微小纖溶酶原的表達。通過誘導前和誘導后的上清液SDS-PAGE便可很直觀的看出是否有目的蛋白的表達。在有目的條帶的前提下進行發色底物測定，通過測定人微小纖溶酶原水解發色底物使其產生淡黃色的對硝基苯胺在波長為405 nm的吸光度來確定人微小纖溶酶原活性強弱。

外源基因多拷貝能使串聯的多個目的基因同時進行轉錄與翻譯，從而達到提高蛋白產量的效果[20]，但少部分研究也表明，單拷貝與多拷貝間并無明顯差異，甚至多拷貝產量更低[21]。這可能是由于外源mRNA 翻譯效率降低，也可能是因為蛋白質通過內質網不能正確折疊或者折疊效率低造成的。