蛇床子素對過氧化氫誘導下人表皮黑素細胞氧化損傷的影響*

李湘君 邊 芳 吳愛萍 瞿平元

白癜風是皮膚科常見的一種難治性獲得性色素脫失性皮膚病。表皮黑素細胞及角質形成細胞處理氧化應激的能力減弱，機體氧化-抗氧化系統失衡，這可能是導致黑素細胞功能障礙，引起白癜風發生的重要病因之一[1]。本研究采用過氧化氫誘導的黑素細胞體外凋亡模型檢測蛇床子素對黑素細胞活性及樹突的影響，并通過檢測SOD和MDA的水平，初步探討蛇床子素治療白癜風的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料M254培養基、人黑素細胞生長添加劑HMGS均購自美國Cascade公司；中性蛋白酶dispase購自廣州威佳科技有限公司；胎牛血清FBS購自美國Gibco公司；二甲基亞砜DMSO、左旋多巴L-DOPA購自美國Sigma公司；MTS購自美國Promega公司；30%過氧化氫為國產分析純。SOD及MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。中藥單體蛇床子素購于中國藥品生物制品檢定所。蛇床子素用DMSO助溶，-20℃冰箱避光保存，2周內使用，臨用時用新鮮的培養基調至終濃度。

1.2 方法

1.2.1 黑素細胞的培養及鑒定取6～20歲健康男性包皮環切術后包皮組織，除去皮下組織后剪成寬約3 mm的細條，0.25%的Dispase酶4℃下消化18 h，分離表真皮，棄真皮，0.25%胰酶消化表皮5 min，反復吹打制成細胞懸液，200目細胞篩過濾，離心后以5×106個/ml密度接種培養。24 h后首次換液，培養至細胞80%～90%融合后傳代。取第3～5代對數生長期細胞進行實驗。L-DOPA染色鑒定所培養細胞為黑素細胞[2,3]。

1.2.2 不同濃度H2O2對人表皮黑素細胞的影響(MTS法)0.25%胰酶消化細胞，制成單細胞懸液，調整濃度為2.5×105/ml，接種于96孔培養板上，每孔100 μl。24 h后吸去培養液，用含濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L H2O2的新鮮培養液于37℃，5%CO2培養箱中培養24 h，每一濃度設5個復孔。培養結束后，分別加入MTS顯色液20 μl，37 ℃繼續孵育4 h后終止培養。應用酶標儀，在測量波長490 nm、參考波長630 nm下測定各孔光吸收值(A)，本實驗重復3次。黑素細胞活力=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.3 蛇床子素對H2O2誘導下黑素細胞活性的影響根據預實驗結果，濃度為20、40、80 μg/ml的蛇床子素具有較好的促黑素細胞生長作用，且呈濃度依賴性，故本實驗選取上述濃度的蛇床子素作為實驗濃度。當過氧化氫濃度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L時，對人表皮黑素細胞活性抑制作用不明顯，但當其濃度增加至0.4 mmol/L時，可顯著抑制黑素細胞活性(P<0.05)。故選擇具有明顯抑制細胞活性作用的最低過氧化氫濃度0.4 mmol/L，進行下一步實驗。實驗分組：對照組(僅添加完全培養基)、過氧化氫組(0.4 mmol/L)、蛇床子素高濃度組(80 μg/ml)、中濃度組(40 μg/ml)、低濃度組(20 μg/ml)，每組設4個復孔。接種細胞方法同上，培養24 h。細胞貼壁后倒去培養基，實驗組每孔分別加入新鮮配制的高、中、低濃度蛇床子素完全培養基100 μl進行預處理，對照組、過氧化氫組僅添加完全培養基，繼續培養24 h。倒去培養基，蛇床子素組及過氧化氫組分別加入新鮮配制的0.4 mmol/L過氧化氫培養基100 μl，對照組僅添加完全培養基，分別培養24 h。之后每孔分別加入20 μl MTS顯色液，繼續培養4 h后終止培養。用酶標儀測定各孔A值，方法同上。

1.2.4 蛇床子素對H2O2誘導下人表皮黑素細胞樹突的影響實驗分組同上，調整黑素細胞濃度為2.5×105/ml，接種于6孔細胞培養板中，每孔1 ml，培養24 h。細胞貼壁后，經高、中、低濃度蛇床子素預處理后加入0.4 mmol/L過氧化氫培養基方法同上，培養24 h后，在倒置相差顯微鏡下分別觀察處理前后各組黑素細胞樹突形態變化，并使用目鏡標尺隨機選取處理前后20個黑素細胞，記錄各組細胞樹突長度。根據公式：樹突變化率=[(處理前黑素細胞樹突長度-處理后黑素細胞樹突長度)/處理前黑素細胞樹突長度]×100%，記錄各組樹突變化率。實驗重復3次[4]。

1.2.5 蛇床子素對H2O2誘導下人表皮黑素細胞內SOD及MDA的影響使用5個25 ml培養瓶培養細胞，實驗分組同上，具體處理同上。培養結束后，分別收集上述對照組、過氧化氫組、蛇床子素高、中、低濃度組細胞，用PBS洗2遍，重懸于0.1%的PBS中，制成細胞數為2×106/ml的細胞懸液，反復凍融細胞3次，倒置相差顯微鏡觀察細胞完全破碎后，以4000 r/min離心15 min，勻漿上清液做SOD及MDA測定。按照試劑盒所述方法，采用WST-1法，酶標儀于550 nm處測定OD值，并計算細胞內SOD活性。采用試劑盒介紹的TBA法，酶標儀于532 nm處測定OD值，測定細胞內MDA含量[5]。

2 結果

2.1 蛇床子素對H2O2誘導下黑素細胞活性的影響經完全隨機設計資料的方差分析檢驗及多個樣本均數間兩兩比較的SNK檢驗，結果顯示過氧化氫組黑素細胞活力(50.83±2.58)%顯著下降 (P<0.05)，蛇床子素高濃度組黑素細胞活力(71.40±2.46)%雖較對照組降低(P<0.05)，但顯著高于過氧化氫組及蛇床子素中、低濃度組(P<0.05)。詳見圖1。

注：圖1各組依次為對照組、過氧化氫組、蛇床子素高、中、低濃度組；與對照組比較，*P<0.05與過氧化氫組比較#P<0.05圖1 蛇床子素對過氧化氫誘導下黑素細胞活力的影響

2.2 蛇床子素對H2O2誘導下黑素細胞樹突的影響使用倒置相差顯微鏡觀察處理前后黑素細胞形態學變化。處理前黑素細胞大多呈長梭形，有1～2支樹突，樹突細長，胞體較小，胞體周圍可見明顯光暈。隨機選取處理前后20個黑素細胞并記錄樹突長度，根據公式計算樹突變化率。結果顯示過氧化氫組黑素細胞樹突變化率(61.28±3.85)%較對照組(8.85±1.90)%顯著升高(P<0.05)，顯微鏡下也觀察到過氧化氫組細胞樹突明顯變短，甚至消失，且胞體呈現皺縮現象，部分細胞懸浮于培養基中，提示過氧化氫可明顯縮短人表皮黑素細胞樹突。蛇床子素高濃度組樹突變化率(31.50±1.13)%及中濃度組(44.25±1.70)%顯著低于過氧化氫組(P<0.05)。詳見圖2。

注：圖2各組依次為對照組、過氧化氫組、蛇床子素高、中、低濃度組；與對照組比較，*P<0.05，與過氧化氫組比較，#P<0.05圖2 蛇床子素對過氧化氫誘導下黑素細胞樹突變化率影響

2.3 蛇床子素對H2O2誘導下黑素細胞內SOD活性及MDA含量的影響采用WST-1法檢測各組黑素細胞內的超氧化物歧化酶(SOD)水平。結果顯示：與對照組相比，過氧化氫組黑素細胞SOD活性(57.90±2.46)nmol·mgprot-1顯著下降(P<0.05)。與過氧化氫組相比,蛇床子素高濃度組與中濃度組黑素細胞內SOD活性顯著升高，分別為(89.24±2.81)nmol·mgprot-1和(81.11±2.88)nmol·mgprot-1(P<0.05)。采用TBA法檢測各組細胞內的丙二醛(MDA)含量。結果顯示過氧化氫組黑素細胞內MDA含量(3.10±0.19)nmol·mgprot-1較對照組顯著上升(P<0.05)，而與過氧化氫組相比，蛇床子素高濃度組的細胞內MDA含量(2.39±0.19)nmol·mgprot-1顯著降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 蛇床子素對過氧化氫誘導下黑素細胞內SOD活性及MDA含量的影響

注：與對照組比較，1)P<0.05；與過氧化氫組比較,2)P<0.05

3 討論

白癜風是皮膚科常見的一種獲得性色素脫失性皮膚病。據統計，目前全世界白癜風的人群患病率為0.5%～4%，我國的人群患病率為0.1%～2.7%，且有逐年增加的趨勢[6]。在發病過程中，黑素細胞及角質形成細胞處理氧化應激的能力減弱與黑素細胞損傷及黑素合成受到抑制密切相關。有學者[7]在檢測白癜風患者體內氧化應激水平時，發現白癜風患者紅細胞中超氧化物歧化酶(SOD)和銅藍蛋白水平明顯降低，而脂質過氧化物丙二醛水平顯著(MDA)升高，表明白癜風患者對氧自由基的清除能力下降。過氧化氫是活性氧自由基(ROS)的重要來源，可自由穿過生物膜，并能和金屬離子如Cu+和Fe2+等發生芬頓反應而產生氧化活性更強的羥自由基。所以過氧化氫可能是造成黑素細胞損傷的重要原因[8，9]。

蛇床子在臨床治療白癜風取得較好療效的中藥配方制劑中出現頻率較高。其主要活性成分為蛇床子素,化學名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素?，F代藥理實驗研究表明, 蛇床子素具有抗高血壓、抗心律失常、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、抗骨質疏松癥等功效[10]。祝雙華等[11]研究發現蛇床子素對高糖誘導的人臍靜脈血管內皮細胞氧化應激損傷具有抗氧化保護作用。蛇床子素體外可直接清除氧自由基O2-·、羥自由基·OH，且同等劑量下效果優于維生素C[12]。羅增香等[4,13]應用蛇床子素作用于體外培養的黑素細胞，研究發現蛇床子素對人黑素細胞酪氨酸酶活性及黑素合成均有較強的促進作用,并且可促進黑素細胞樹突的生成。

筆者通過試驗檢測蛇床子素對過氧化氫誘導下黑素細胞活性及樹突的影響，結果顯示：過氧化氫組黑素細胞活力顯著下降(P<0.05)，蛇床子素高濃度組的黑素細胞活力雖低于對照組(P<0.05)，但顯著高于過氧化氫組。過氧化氫組黑素細胞樹突變化率較對照組顯著升高(P<0.05)，蛇床子素高、中濃度組的黑素細胞樹突變化率顯著低于過氧化氫組(P<0.05)。提示在過氧化氫誘導的黑素細胞氧化損傷模型中，蛇床子素對黑素細胞的活性及樹突的影響具有保護作用。此外，本研究檢測了黑素細胞內MDA和SOD的水平，結果顯示：過氧化氫組與對照組相比細胞內SOD活性顯著下降(P<0.05)，MDA含量顯著上升(P<0.05)。經80 μg/ml及40 μg/ml蛇床子素高、中濃度組的細胞內SOD活性較過氧化氫組顯著升高(P<0.05)，蛇床子素高濃度組的細胞內MDA含量較過氧化氫組顯著降低(P<0.05)。提示過氧化氫可顯著降低黑素細胞內SOD水平及升高MDA水平，而蛇床子素可明顯抑制過氧化氫的氧化應激作用，升高細胞內SOD水平，并降低MDA水平。通過上述試驗，我們推測中藥單體蛇床子素對黑素細胞的氧化應激損傷具有一定抗氧化保護作用，為蛇床子素治療白癜風提供了一種新的作用機制，可成為臨床上治療此類疾病的一個新的作用靶點。