蓖麻餅粕蛋白酶解及毒素去除工藝研究

冀照君 穆莎茉莉 張繼星

摘要 蓖麻餅粕經105 ℃烘干2 h并粉碎至40目后，采用中性蛋白酶對蓖麻餅粕蛋白進行酶解，采用響應面法對酶解工藝進行了優化。結果表明，當酶用量為6.2 IU/mg（以物料質量計）、底物濃度（物料蛋白∶水）為6.0% 、溫度為45 ℃、pH為7.4、水解3.8 h時，蓖麻蛋白水解效果較好，水解度達8.16%。經冷水浸提過濾及離心處理，所得蛋白酶解液中蓖麻堿去除率為83.19%，其他毒素未檢出。該酶解工藝有效去除了蓖麻毒素，進一步拓寬了蓖麻餅粕的利用空間。

關鍵詞 蓖麻餅粕;蛋白酶;酶解;毒素

中圖分類號 TS209文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0156-04

Abstract Castor meal was smashed to 40mesh at 105? ℃ for 2 h，and hydrolyzed with neutral protease.Then response surface methodology was used for optimizing the hydrolytic conditions.The results showed that good hydrolytic effectiveness was obtained and the degree of hydrolysis （DH） reached 8.16%，under the optimal conditions of enzyme dosage 6.2 IU/mg （calculated by material quality），substrate concentration 6.0% （the rate of protein to water），temperature 45? ℃，pH 7.4 and reaction time 3.8 h.The removal rate of ricin was 83.19% and the content of other toxins was not detected in protein hydrolyzates，which was extracted by cold water and centrifuged.The enzymatic hydrolysis technology could remove ricin effectively，and further broaden the availability of castor cake meal.

Key words Castor meal;Protease;Enzymolysis;Toxin

蓖麻（Aicinus communis L.）屬大戟科蓖麻屬喜溫植物，種質資源十分豐富[1]。蓖麻籽粒經榨油后所得的廢棄物稱為蓖麻餅粕。Gionbelli等[2]研究發現蓖麻餅粕中尚存在4種毒素物質，即蓖麻毒蛋白、血球凝集素、變應原和蓖麻堿，嚴重阻礙了進一步的加工利用，主要被當做農田肥料施加到田間，只有少量添加到動物飼料中[3-4]。為了開拓蓖麻餅粕的在食品工業中的利用空間，很多學者對蓖麻餅粕的成分進行了分析。研究發現，蓖麻餅粕除含有粗纖維、碳水化合物外，還含有豐富的粗蛋白（含量高達33%～35%）、多種礦物質元素（如鈣、鋅、鐵等），是一種天然的優質資源[5]。蓖麻餅粕的脫毒工藝研究一直是學者們關注的問題[6-8]，迄今已研究出多種蓖麻餅粕的脫毒方法[9]。但關于蓖麻餅粕粗蛋白的再利用研究報道甚少，2015年于麗娜等[10]首次采用蛋白酶對蓖麻蛋白進行了酶解處理并測定了產物的抗氧化特性，但未測定產物中毒素的含量。蓖麻餅粕中除蓖麻堿外，其他毒素分子中均含有蛋白質長鏈結構，高溫變性后很容易受到蛋白酶分解而去除，純蓖麻堿則微溶于冷水，可以通過低溫離心法去除[11]。筆者采用蛋白酶在最適條件下對高溫變性后的蓖麻餅粕進行處理，不僅可以破壞毒素的分子結構，去除毒素，而且還能使蛋白質轉變為肽或氨基酸，易于消化吸收，分解后的蛋白質可以很好地溶于水中，然后將水解液冷卻離心，得到無毒的蓖麻水解粗提液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。蓖麻餅粕，購自通遼通化化工有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備。PHS-3C型精密pH計，為上海精密科學儀器有限公司產品; KDN-04C型凱氏定氮儀，為鄭州南北儀器設備有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 總氮量的測定?？偟康臏y定采用微量凱氏定氮法[12]。

1.2.2 氨基氮含量的測定。氨氫氮含量的測定采用甲醛滴定法[13]。取5 mL蓖麻餅粕蛋白酶解后產物，加入60 mL蒸餾水并攪拌10 min。用已標定的0.05 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至pH為8.2，并保持1 min，緩慢加入甲醛10 mL并攪拌3 min。然后，再次滴定至溶液pH為9.2，記氫氧化鈉標準溶液體積為V1。

同時，取另外5 mL酶解前的蓖麻餅粕溶液作為空白對照，按照上述方法進行滴定，記氫氧化鈉標準溶液體積為V0。按照以下公式計算氨氨基氮含量：

式中，V1為滴定酶解后產物消耗氫氧化鈉標準溶液的體積（mL）;V0為滴定酶解前溶液消耗氫氧化鈉標準溶液的體積（mL）;C為氫氧化鈉標準溶液濃度;14.008為氫氧化鈉中氮當量常數，單位為mg/mL;5為所取樣品的體積，單位為mL。

1.2.3 水解度的計算。

采用水解度作為蓖麻餅粕蛋白酶解工藝優化的指標，水解度的計算公式[14]如下：

1.3 工藝流程及操作要點。

1.3.1 工藝流程。工藝流程如圖1所示。

1.3.2 主要操作要點。

1.3.2.1 原料烘干及粉碎。

由于榨油后的蓖麻餅粕中含有一定的水分，并且顆粒較大，因此需要將餅粕進行初步烘干并粉碎至所需的粒度。將蓖麻餅粕于105 ℃下烘干2 h，采用高速粉碎機粉碎至40目[15]，待用。

1.3.2.2 酶解。

將上述預處理原料中加入蒸餾水制成一定濃度的混合物，然后勻漿處理，底物濃度（以物料中蛋白質含量所占百分比計）分別為3%、4%、5%、6%、7%;調節pH，加入一定量的中性蛋白酶在設定好的溫度下進行酶解，酶用量分別為3、4、5、6、7 IU/g，以水解度為指標，研究蓖麻蛋白酶解的最佳工藝條件。每個處理重復3次，試驗結果均取3次重復的平均值。

1.3.2.3 滅酶。

滅酶的目的是防止酶解過程影響水解度的測定結果。采用90 ℃加熱5 min的方式，以滅掉蛋白酶的活性。

1.3.2.4 粗肽液分離及毒素檢測。

酶解后，將混合物進行8層紗布過濾，然后緩慢冷卻至2～4 ℃，使蓖麻堿逐漸形成不溶性晶體而析出，通過冷凍離心（8 000 r/min，10 min）去除不溶解成分，取上清液即為粗肽液，血球凝集素、蓖麻毒蛋白、變應原的提取及檢測采用高效液相色譜法[16]，蓖麻堿的檢測采用紫外分光光度法[11]。

1.4 試驗設計

在單因素試驗的基礎上，經分析發現在酶解過程中酶用量、底物濃度、酶解溫度、酶解時間對酶解效果的影響較為顯著，而pH對酶解效果的影響較小，因此以酶用量、底物濃度、酶解溫度和酶解時間4個因素為自變量（x），以水解度為響應值（Y），利用Design-Expert 7.1軟件的中心旋轉組合設計[17]，共進行31個試驗點，取3次平行試驗的平均值。中心旋轉組合因素與水平設計見表1。

1.5 數據統計與分析 使用Design-Expert 7.1軟件和Excel 2010軟件對試驗數據進行統計與分析。

1.6 模型的驗證

通過響應面分析法（response surface methodology，RSM）優化蓖麻餅粕酶解的工藝條件，并在模型預測的最優條件下再次對蓖麻餅粕蛋白進行酶解，比較預測值和試驗過程中的測定值來驗證模型適用于該研究的程度。

2 結果與分析

2.1 回歸模型的擬合 中心旋轉組合設計試驗結果見表2。

蓖麻餅粕蛋白酶解工藝采用RSM優化法建立了相應的數學模型，蓖麻餅粕蛋白水解度的回歸方程如下：

通過上述回歸模型計算出的蓖麻餅粕蛋白水解度預測值Y與實際試驗過程中所測定得到的水解度進行擬合，結果見圖2。從圖2可以看出，該回歸方程所計算的預測值與實際測定值擬合良好，因此該方程可用于評估蓖麻餅粕蛋白的酶解工藝參數和酶解結果。

2.2 自變量對響應值的影響

蓖麻餅粕蛋白酶解后所得水解度受回歸方程中回歸系數的影響。由表3可知，x1、x2、x3、x4、x3x4、x12、x22、x32、x42項對水解度有顯著影響，其他因素的影響不顯著。根據回歸方程的原理，一次項回歸系數對水解度的影響最大，其絕對值大小依次分別為x4、x1、x2、x3。這表明影響蓖麻餅粕蛋白水解度最主要因素為酶解時間，其次為酶用量、底物濃度、酶解溫度。為了形象地描述各因素對響應值的影響，各因素對水解度影響的響應值見圖3～8。

2.3 最適條件和回歸模型的驗證

通過該回歸模型，采用Design expert 7.1軟件優化蓖麻餅粕蛋白酶解條件，得出最適工藝條件：酶用量6.2 IU/mg、底物濃度6.0%、酶解溫度45 ℃、酶解時間3.8 h，并調節pH至7.4，在此條件下蓖麻餅粕蛋白水解度的預測值為8.20%，而實際測得的水解度為8.16%，實際值與預測值之間的相對誤差為0.04%，差異不顯著。

將粗提液采用高效液相色譜法進行測定后，發現蓖麻毒蛋白、變應原、血球凝集素的毒素均未檢出，蓖麻堿去除率為83.19%。因此，采用RSM法優化得到的工藝條件可以有效去除蓖麻餅粕中的各種毒素。

3 結論與討論

蓖麻餅粕作為蓖麻籽榨油后的廢棄產品，絕大部分作為肥料施加到田間[5，9]，只有少量餅粕添加到動物飼料[6，9]，造成了嚴重的資源浪費，因此蓖麻餅粕的再利用一直備受研究者們的關注。烘干并粉碎后的蓖麻餅粕經中性蛋白酶處理后，水解度可達8.16%。采用水洗法去除了酶解產物中83.19%的蓖麻堿，其他毒素均未檢出。該研究中酶用量和底物濃度對蓖麻餅粕水解度的影響較為顯著，蓖麻餅粕經過105 ℃烘干后，蓖麻毒蛋白、血球凝集素、變應原及其他蛋白質分子結構中的蛋白質部分已變性，酶結合位點充分暴露，中性蛋白酶可以有效降解蛋白質大分子[10]，分解為多肽或氨基酸含量較高的酶解產物，這與大豆蛋白酶解過程相似[19]。該試驗中酶解時間對蓖麻餅粕蛋白水解度的影響也很大，這可能是由于蓖麻餅粕中部分蛋白質結構較為復雜，如糖結合蛋白[4]，酶反應速度相對緩慢。另外，采用已有的水洗法去除酶解產物殘存的蓖麻堿，可避免其他營養成分的丟失[11]?？偠灾?，采用酶解的方法對蓖麻餅粕進行處理，不僅可以去除毒素，而且豐富了酶解產物的營養成分，易于消化吸收，極大地拓寬了蓖麻餅粕的進一步利用空間。

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