玉米小斑病抗病鑒定接種培養基的產孢技術

蒙成 黃艷花

摘要：以玉米小斑病病菌野生型菌株為試材，探索不同植物組織培養基、溫度、培養時間、高低溫誘導、光照等條件對分生孢子產生的影響。采用單因素組配18種植物組織培養基，共18個處理，3次重復;設A、B 2個供試溫度處理，溫度梯度設9個處理，3次重復;設9個培養時間段，3次重復;設6個高、低溫誘導處理，3次重復;設6種不同光照處理，3次重復。結果表明，培養基的成分組合對分生孢子的產生起決定性作用，配方為100.0 g高粱、0.2 g 硫酸鎂、0.2 g 磷酸鈉、15.0 g玉米葉的7號培養基最佳，產孢量最多，產孢量為16.8×104個/g;配方為100 g玉米粒、0.2 g硫酸鎂、0.2 g磷酸鈉、15.0 g玉米葉的9號培養基次之，產孢量第2，產孢量為10.8×104個/g。在溫度為24 ℃條件下培養的產孢量最多;培養時間在35 d內，培養的時間越長，產孢量越多;高溫為35 ℃、低溫為4 ℃誘導對玉米小斑病病菌產孢量均有一定的促進作用，但經過高、低溫誘導后產生的部分分生孢子一端連接1節分生孢子梗;光暗交替各 12 h、光照度為2 000 lx，分生孢子產孢量最高。研究認為，能促進玉米小斑病病菌分生孢子產量增加的最佳組織培養基配方為100 g高粱、0.2 g硫酸鎂、0.2 g磷酸鈉、15.0 g玉米葉;該培養基在24 ℃、光暗交替各12 h、光照度為 2 000 lx 的條件下，分生孢子產量最高;培養時間在35 d內時，培養的時間越長，產孢量越高;在高溫為35 ℃、低溫為 4 ℃ 下誘導，對玉米小斑病病菌產孢量均有一定的促進作用，但誘導后產生的部分分生孢子形態發生改變。

關鍵詞：玉米;小斑病菌;培養基;產孢技術;分生孢子

中圖分類號： S435.131.4+9? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0144-04

玉米小斑?。╯outhern corn leaf blight，簡稱SCLB）是世界玉米主產區的重要病害[1]，是我國溫暖潮濕玉米產區的重要葉部病害[2]，在玉米全生育期均可發生，發生高峰期為植株抽雄后，感病品種在一般發病年份可減產10%以上，嚴重發生年份可減產20%～30%[3]。利用抗病種質資源，選育和種植抗病品種是控制玉米小斑病流行的有效措施[4]，在抗病品種的選育與利用過程中，抗病性鑒定已成為玉米育種及其區域適應性的一個常規工作，而獲得大量分生孢子，或者獲得帶大量分生孢子的菌粒是玉米小斑病抗病性接種鑒定工作順利進行的基礎條件。因此，研究并獲得大量分生孢子，對玉米小斑病抗病性接種鑒定具有十分重要的意義。玉米小斑病分生孢子通常采用高粱粒組織培養基來培養[5]，產孢效果不甚理想，且在培養過程中容易受到雜菌污染，滋生小昆蟲。楊秀娟等發明了CN201510411758.9《一種玉米小斑病菌產孢培養基及其制備方法和應用》，用該方法培養的病菌產孢量約為等量馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基產孢量的1.2～3.6倍，但是該方法還是利用平板培養基進行產孢，其產孢、取孢操作過程繁瑣，不便于大面積抗病鑒定操作，不能用帶病菌培養基進行接種。國內至今從系統分析角度對玉米小斑病病菌產孢技術進行研究的報道尚不多[6-10]。在玉米小斑病抗病鑒定試驗中，通常采用隨機分離得到的玉米小斑菌病菌作為供試菌株，有時采用的菌株致病力不強，對抗病鑒定效果不理想;在病菌分離過程中，常采用稀釋法進行單孢分離，不能確定是否得到了單細胞純培養;在病菌保存中，常采用PDA培養基進行培養后保存，但因PDA培養基營養較高，病菌生長旺盛，保存后菌株的活力容易衰退。為了獲得產孢效果好、成本低且操作簡單、便于進行大面積抗病鑒定的操作方法，本研究采用標記法進行單孢分離獲得菌株，以低營養培養基作為菌株保存基質，從而獲得大量分生孢子，并經致病力鑒定篩選菌株，確保菌株純度、致病力及活力，為大面積開展玉米小斑病抗病性鑒定提供保障。本研究以常用接種基物高粱粒、小麥粒及玉米粒為主要材料，以玉米葉、甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉等為配料，組配18種植物組織培養基進行產孢培養試驗，并對各種產孢培養條件進行初步探索，以尋找1種適合玉米小斑病抗病鑒定用高產分生孢子的培養基及其培養方法，為玉米小斑病抗病性接種鑒定工作簡單、高效、準確地開展提供保障。

1 材料與方法

本試驗于2017年在廣西農業職業技術學院植物保護實驗室完成。

1.1 供試菌株

玉米小斑病病菌野生型菌株由廣西農業職業技術學院作物研究所玉米試驗田的感病病株上采集分離獲得，病原菌分離與培養采取常規分離方法，采用病菌孢子稀釋純化法，將病菌產生的分生孢子配制成懸浮液，涂抹于PDA平板培養基上，產生病菌單孢菌落，最終獲取純化菌株，獲得病菌的純培養物[11]。

1.2 供試培養基

供試的培養基分別以高粱粒、小麥粒及玉米粒為主要材料，以玉米葉、甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉等為配料，單因素組配18種培養基。高粱粒處理方法如下：挑選籽粒飽滿、大小一致、無病蟲的帶皮高粱水煮25 min，經水洗瀝干備用;小麥粒處理方法如下：挑選籽粒飽滿、大小一致、無病蟲的帶皮小麥粒浸泡20 min后，水煮15 min后水洗瀝干備用;玉米粒的處理方法如下：挑選大小一致、無病蟲的玉米粒浸泡 12～15 h，水煮1 h，水洗瀝干備用;玉米葉用剛從大田采集的新鮮玉米葉，切成約1 cm2左右的碎片備用;培養基制作方法如下：按配方配制，把所需成分混勻，濕度以藥品能溶解，玉米葉能摻和在籽粒上而無滴水為宜。將配好的培養基裝入 250 mL 三角瓶中，每瓶裝100 g配好的培養基，于121 Pa高壓滅菌45 min備用。

1.3 供試儀器

試驗用培養箱為LRH-250-GSB1珠江牌培養箱。

1.4 不同培養條件對分生孢子產量的影響

1.4.1 培養基對分生孢子產量的影響 單因素組配18種植物組織培養基進行產孢量試驗，每個配方1個處理，每個處理3次重復，共18個處理，具體配方見表1。玉米小斑病病菌菌種在PDA培養基上擴繁6 d，菌絲長滿9 cm培養皿后，用帶PDA培養基的菌絲接種到供試植物組織培養基上，每份處理接種半皿菌種（下同）。接種后的培養瓶于24 ℃、全黑暗條件的培養箱中培養11 d，測定產孢量。

1.4.2 溫度對分生孢子產量的影響 以7號培養基為供試培養基，分別在12、16、20、24、26、28、32、36、40 ℃共9個溫度梯度下黑暗培養11 d[12]，3次重復。設A、B 2個處理：A處理為接種后的培養基瓶分別直接于各溫度培養11 d后測定產孢量;B處理為接種后的培養基瓶于26 ℃全黑暗條件下培養5 d，菌絲長滿培養基后轉入各溫度下繼續培養6 d后測定產孢量。

1.4.3 培養時間對分生孢子產量的影響 7號培養基為供試培養基，將接種后的培養瓶分別放入溫度為20、24 ℃的黑暗條件培養箱中培養，分別于培養5、7、9、11、15、20、25、30、35 d時測定產孢量，重復3次。

1.4.4 高、低溫誘導對分生孢子產量的影響 7號培養基為供試培養基，把接種后的培養基瓶放入溫度為26 ℃的全黑暗條件下培養5 d，菌絲長滿培養基后轉入各高、低溫條件下進行誘導處理，處理結束后放入溫度為24 ℃的黑暗條件下繼續培養6 d后測定產孢量。設7個處理：溫度為4 ℃，分別處理12、24、48 h;溫度為35 ℃，分別處理12、24、48 h與對照（26 ℃ 全黑暗下培養5 d后直接轉入24 ℃黑暗培養 6 d）[13]，重復3次。

1.4.5 光照對分生孢子產量的影響 7號培養基為供試培養基，分別使用24 h黑暗、12 h黑暗+12 h光照（1 500、2 000、3 000 lx共3種不同光照度梯度）、24 h光照（光照度為 3 000 lx），在這3種不同光照方式處理下于24 ℃恒溫培養 11 d[14]。

1.5 分生孢子產量的測定

取各處理2 g含病菌的培養基放入50 mL燒杯中，加 10 mL 水，用不繡鋼勺子連續攪拌約100次，以保證能將菌株所產生的分生孢子刮下至孢子脫落至水里，過濾得到孢子懸浮液，用血球計數板計算1 mL孢子懸液中所含孢子數，折算成1 g培養基產生的孢子量。每個處理取樣3次，每樣品讀數3次。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對病菌分生孢子產量的影響

由圖1可知，不同培養基對玉米小斑病病菌產孢子量有明顯影響，14個配方的培養基產孢量超過對照（常用的高粱培養基），配方7號培養基產孢子數量最多，為16.8×104個/g;配方9號培養基產孢子量次之，為10.8×104個/g;排在第3、4位的為13、11號培養基，產孢量分別為8.0×104、7.7×104個/g;14、2、6號培養基產孢量相當，分別為5.7×104、5.5×104、5.2×104個/g; 3、4、8、15、18、12、10號培養基的產孢量依次為3.2×104、2.7×104、2.1×104、1.3×104、

1.2×104、1.2×104、1.1×104個/g;常用的高粱培養基（CK）產孢量為6.8×103個/g，17、16、5號培養基產孢量少于對照，分別為6.5×103、2.2×103、5.4×102個/g。因此可見，7號培養基為玉米小斑病病菌分生孢子產生的最佳培養基。

2.2 溫度對病菌分生孢子產量的影響

由圖2可知，培養溫度對玉米小斑病病菌分生孢子產量的影響較大，溫度過低或過高都不利于分生孢子的產生，處理A在溫度≤12 ℃或≥32 ℃時，均不產生分生孢子，在溫度為 16～28 ℃時，能夠產生孢子，在溫度為20～26 ℃時，產孢量最多，其中在溫度為24 ℃的條件下產孢量最多;處理B在溫度為12～40 ℃的條件下均可以產生分生孢子，26 ℃時產孢量最高，24 ℃時次之。因此，將接種后的培養基在24 ℃條件下進行培養是玉米小斑病病菌分生孢子產生的最適宜溫度。

2.3 不同培養時間對病菌分生孢子產量的影響

由圖3可知，培養時間對玉米小斑病病菌產孢量影響較大，在溫度為20、24 ℃的條件下培養，培養時間在35 d內時，培養時間越長，產孢量越多;培養時間在30 d內時，24 ℃處理的產孢量均高于20 ℃處理。因此，在溫度為20、24 ℃的條件下培養，培養時間為35 d是玉米小斑病病菌分生孢子產生量最多的時間。

2.4 高、低溫誘導對病菌分生孢子產量的影響

由圖4可知，在溫度為4 ℃中冷凍24 h的處理產孢量最高，為4.2×105個/g;35 ℃熱激24 h的處理效果次之，產孢量為3.5×105個/g;35 ℃熱激48 h與4 ℃冷凍12 h的效果相差不大，產孢量分別為3.2×105、3.1×105個/g;4 ℃冷凍 48 h 與35 ℃熱激12 h處理與對照差別均不明顯。研究發現，高、低溫誘導對玉米小斑病病菌產孢量均有一定的促進作用，但是經過高、低溫誘導后產生的部分分生孢子一端連接1節分生孢子梗，對分生孢子的活性是否產生影響有待進一步研究。

2.5 不同光照條件對病菌分生孢子產量的影響

由圖5可知，光照條件對玉米小斑病病菌產孢量有一定的影響，適量的光照對該病菌產孢量有促進作用。在連續 24 h 黑暗條件下不利于產孢，產孢量為1.9×105個/g;12 h黑暗+12 h光照（2 000 lx光照度）條件下產孢量最多，達到 4.6×105個/g;12 h黑暗+12 h光照（1 500 lx光照度）條件下產孢量次之，為3.3×105個/g;高強度光照即12 h黑暗+12 h光照（3 000 lx光照度）條件對該病菌產孢量有抑制作用，產孢量為2.5×105個/g;連續24 h光照（光照強度為 3 000 lx）條件下最不利于產孢，產孢量為1.4×105個/g。因此，12 h黑暗+12h光照（2 000 lx光照度）條件最有利于玉米小斑病病菌分生孢子的生長，產孢量最多。

3 結論與討論

在促進植物病原真菌產孢的研究進程中，有研究表明，培養基與孢子產生的關系最大， 采用不同的培養基或者改變它們 的成分， 是促進孢子產生的最主要途徑[11]。研究表明，不

同培養基對多數茄鏈格孢的產孢量有明顯影響[15-16]。因此，前人開展了通過培養基促進產孢量的研究工作，結果表明，綠豆湯培養液是蕉斑鐮刀菌液體搖瓶產孢最好的培養液，在適宜條件下，產孢量達到1×106 mL[17];蘋果腐爛病病菌在加蜂蜜水和蛋白胨的帶殼大麥上能大量產孢[18];辣椒疫霉菌在胡蘿卜、黑麥和燕麥培養基中均能產生孢子囊，在胡蘿卜培養基上產生孢子囊的數量最多[19]。本研究選用18種不同培養基誘導玉米小斑病病菌分生孢子的產生，研究發現，使用配方為100 g高粱、0.2 g硫酸鎂、0.2 g磷酸鈉、15.0 g玉米葉的7號培養基和配方為100 g玉米、0.2 g硫酸鎂、0.2 g磷酸鈉、15.0 g 玉米葉的9號培養基產孢量較多，分別為16.8×104、10.8×104個/g;17、16、5號培養基產孢量最少，分別為6.5×103、2.2×103、5.4×102個/g。

有研究表明，玉米小斑病病菌產孢最適溫度為25 ℃[20];玉米小斑病斑產孢的適宜溫度為20～30 ℃，最適溫度為 26 ℃，在5 ℃以下、35 ℃以上不能產孢[10]。本研究發現，玉米小斑病病菌在溫度12 ℃以下或32 ℃以上時，病原菌菌絲體生長緩慢，不能產孢;在溫度為16～28 ℃時，病原菌菌絲生長速度快，能夠產孢;在溫度為20～26 ℃時，病原菌產孢量迅速增加，在溫度為 24 ℃ 的條件下，產孢量最多。長菌絲后的培養基轉入各溫度中均可以產孢，在溫度為26 ℃時，產孢量最高，24 ℃次之。說明該病菌的菌絲生長溫度條件高于分生孢子產生的條件，菌絲一旦生成，在較高和較低的溫度條件下，分生孢子均能產生，這可能是玉米小斑病病菌能在全世界玉米產區發生的原因之一。

本研究發現，培養時間對玉米小斑病病菌產孢量影響較大，在溫度為20、24 ℃的條件下培養，在培養時間為35 d內，培養時間越長，產孢量越多。與前人研究結果[21]基本一致。

在高溫為35 ℃、低溫為4 ℃的條件下誘導，對玉米小斑病病菌產孢量均有一定的促進作用，但經過高、低溫誘導后產生的部分分生孢子一端連接1節分生孢子梗，對分生孢子的活性是否產生影響有待進一步研究。

本研究發現，光照條件對玉米小斑病病菌產孢量有一定的影響，適量的光照對該病菌產孢量有促進作用，在12 h光照+12 h黑暗交替且光照度約為2 000 lx的條件下產孢量最多。與前人研究的光照能顯著抑制病菌產孢的結果[1]有一定出入，須進一步通過試驗驗證。

利用單因素組配確定促進玉米小斑病病菌分生孢子產量增加的最佳組織培養基配方為100 g高粱、0.2 g硫酸鎂、0.2 g 磷酸鈉、15 g玉米葉的7號培養基;該培養基在溫度為24 ℃、光暗交替各12 h、光照度為2 000 lx的條件下，分生孢子產量最高;培養時間在35 d內，培養的時間越長，產孢量越高。高溫為35 ℃、低溫為4 ℃誘導對玉米小斑病病菌產孢量均有一定的促進作用，但誘導后產生的部分分生孢子形態發生改變。

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