TLR4基因在綿羊不同生理狀態下子宮內膜組織中的mRNA表達

孔維歡 熊燊源 代蓉

摘要：為了研究Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）在綿羊胚胎附植期和發情周期子宮內膜中mRNA的表達模式。采用半定量RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR分別檢測妊娠21 d母羊全身組織和妊娠9、13、17、21、25 d 的母羊子宮內膜組織TLR4基因的表達以及綿羊卵泡期與黃體期母羊子宮內膜組織TLR4基因的表達。結果表明，TLR4基因在肝臟、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮、小腸、膀胱、肌肉及松果體等組織出現表達，其中在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體中表達量較高，在肝臟、小腸、肌肉中表達較弱，而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達。從妊娠9 d開始，綿羊胚胎TLR4基因表達量呈逐漸下降趨勢;至胚胎附植點17 d，TLR4基因表達量最低，之后又呈現上升趨勢，到25 d達到峰值。不管是在細毛羊還是在湖羊子宮內膜組織中檢測，TLR4基因黃體期的表達水平均顯著高于卵泡期（P<0.05）。說明TLR4的mRNA表達具有組織特異性，在胚胎附植期綿羊子宮內膜中呈現先低后高的趨勢，以及其在綿羊發情周期中表達出現黃體期顯著高于卵泡期現象，也初步說明了TLR4可能在胚胎附植早期和發情周期中均發揮一定作用。

關鍵詞：TLR4基因;綿羊;胚胎附植期;發情周期;子宮內膜

中圖分類號： S826.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0035-05

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR） 是一類典型的Ⅰ型模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR）[1-3]。據調查，近些年來對動物繁殖相關的疾?。鳟a、子宮內膜炎、乳腺炎等）與天然免疫受體TLRs的關聯性分析研究逐年增多。而其中TLR4受體基因是當前醫學領域研究最為廣泛的，隨著國內經濟的發展、人們生活水平的提高、人均壽命的增長，內分泌性疾病發病率的不斷上升，子宮內膜樣癌的發病呈現逐漸年輕化的趨勢，子宮內膜樣癌的發病與體內外多種因素有了密切的關聯[4]，其中長期受到雌激素刺激和缺乏孕激素拮抗作用就是子宮內膜發生癌變的主要外界因素。因而母-胎界面中的免疫調節機制也成了許多免疫學家一直的研究熱點，并證實了TLR4在生殖免疫系統中發揮著重要的作用。比如，Romero等認為早產主要就是因為生殖道的感染進而引發了炎癥所導致的[5]。母-胎界面作為妊娠時聯系母體和胎兒的重要屏障保護組織，其上各類促炎癥因子的表達情況被證明是與正常的妊娠和分娩相關的[6]。而哺乳動物妊娠建立的標識則是胚胎的附植，它是胚胎與母體復雜的多基因雙向調控作用的結果。有研究表明，雌性動物生殖道內有大量表達TLR1-6等免疫受體，在2004年，Pioli等的相關研究中，TLR4受體基因在人類的輸卵管、子宮內膜、子宮頸等生殖器中呈現出差異性表達[7]。2007年，Nishimura等在人類的卵巢、輸卵管以及子宮中同樣檢測到了TLR1-10等受體基因的表達[8]。所以，推測TLR4與雌性動物生殖免疫的關聯性可能表現為其在雌性動物不同生理階段所發揮出的作用。

鑒于TLR4基因在綿羊胚胎附植期及發情周期對子宮和孕體分子調控模式的研究鮮有報道，本試驗選擇該受體作為綿羊不同生理階段表達調控的目的基因，試圖通過組織表達譜檢測分析、半定量RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR技術，探究其在胚胎附植期和發情周期的不同階段子宮內膜中的差異表達，初步揭示TLR4受體在哺乳動物繁殖免疫調節過程中發揮的重要作用，也為了解該受體的免疫功能機制提供了一定的理論數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物：來自新疆農墾科學院畜牧研究所的試驗種羊場。其中中國美利奴細毛羊30只、湖羊10只。選擇的首要標準是3胎以內的成年羊，體質量為35～45 kg，個頭適中、體型良好、膘情中上、哺乳性好，無生殖免疫系統等方面的疾病。其次是飼養環境及各品種綿羊個體之間等無明顯差異。

試驗藥劑：孕酮海綿栓（澳大利亞 Intervet Pty.Ltd.，500 mg/支），孕馬血清促性腺激素（PMSG）（浙江寧波第二激素廠，1 000 IU/支），Trizol 試劑（Invitrogen公司），瓊脂糖（Biowest公司），三氯甲烷、異丙醇（北京化工廠），反轉錄試劑盒、ddH2O（北京全式金公司），dNTP、Taq 酶、10×Buffer、DNA Marker（TaKaRa公司），480 SYBR GreenⅠMaster（Roche公司）。

試驗儀器：高速冷凍離心機、可調式微量移液槍、-80 ℃冰箱（Thermo公司），4 ℃冰箱、微波爐（美的公司），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），制冰機（Grant公司），電子分析天平（美國丹佛公司），超凈工作臺（上海博訊公司），電泳儀、紫外分光光度計（Bio-Rad公司），UV凝膠成像系統（Uvitec Cambridge公司），PCR擴增儀（Heraeus 公司），圓周振蕩器（IKA公司），高壓滅菌鍋（Sanyo公司），LightCycler 480實時熒光定量PCR系統（Roche公司）。

1.2 試驗方案

首先隨機把細毛羊分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5 組（每組3只），利用孕酮海綿栓與PMSG結合的方法將綿羊進行同期發情處理，發情母羊間隔12 h左右采用人工授精，重復2～3次。其次，再把細毛羊和湖羊2種綿羊各自隨機分為 A、B 2組，3只/組，同樣的方法經過同期發情處理。

人工授精后9、13、17、21、25 d，采集細毛羊妊娠母羊的子宮內膜組織以及細毛羊、湖羊卵泡期和黃體期的子宮內膜組織，迅速置于液氮保存備用;并對妊娠21 d 的3只細毛羊進行屠宰，采集其心臟、肝臟、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮、小腸、膀胱、松果體、垂體以及肌肉、脂肪等12 種組織，迅速置于液氮中保存備用。

1.3 試驗設計

試驗于2017年5—7月在新疆農墾科學院新疆兵團綿羊繁育生物技術重點實驗室進行。

1.3.1 總RNA的提取和單鏈cDNA的轉錄合成 各組織樣品均取100 mg，放入液氮中進行研磨處理，然后按照Trizol試劑說明書的步驟分別提取所需綿羊組織的總RNA。利用紫外分光光度計測定出RNA的D值（D260 nm/D280 nm）和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。所提總RNA的D值在1.8～2.0之間，且沒有蛋白和基因組污染，符合試驗要求。單鏈cDNA的轉錄合成按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒說明書結合試驗所需進行適當調整。

1.3.2 引物設計及合成 根據GenBank中綿羊TLR4基因mRNA序列（XM_012111214.1），應用軟件Primer 5.0進行引物設計（表1），引物跨內含子并處在基因的高保守區域，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 TLR4基因克隆 以反轉錄合成的單鏈cDNA為模板進行PCR擴增。反應總體積為25 μL，反應體系：10× buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，TLR4上下游引物F/R各 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 16.0 μL，cDNA模板3.0 μL。PCR 反應優化條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環;最后72 ℃延伸7 min。得到的PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA測序由英濰捷基（上海）貿易有限公司完成，經鑒定所得序列正確。

1.3.4 組織表達譜分析 按照上述方法分別提取妊娠 21 d 母羊心臟、肝臟、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮、小腸、膀胱、松果體、垂體、肌肉、脂肪等12種組織的總RNA，并反轉錄合成cDNA單鏈。再根據所設計的TLR4上下游引物F/R對其單鏈進行PCR擴增。以綿羊GAPDH基因作為內參基因，根據該持家基因指數擴增期PCR產物的灰度調整各組織初始模板的濃度，并與TLR4目的基因指數擴增期PCR產物的灰度進行比值，進而利用半定量法分析出TLR4基因在所選的12種組織中的相對表達水平。

1.3.5 實時熒光定量RT-PCR檢測 采集2種不同生理狀態下的細毛羊和湖羊的各個不同時期不同階段的子宮內膜組織，分別提取它們的總RNA，同樣反轉錄合成 cDNA單鏈，然后進行實時熒光定量PCR檢測。根據所設計的TLR4上下游引物F/R進行PCR擴增，同樣以綿羊GAPDH基因作為內參基因，進行同樣條件下的定量擴增和檢測。反應體系 20.0 μL，包括2×SYBR premix EX Taq TM 10.0 μL，上下游引物F/R各0.4 μL，ddH2O 7.2μL，模板cDNA 2.0 μL。PCR反應擴增程序：94 ℃預變性30 s;94 ℃變性5 s，60 ℃ 復性 15 s，72 ℃延伸20 s，共45 個循環。擴增完成后，進行熔解曲線的分析，并判斷擴增過程及產物的特異性。每個檢測樣品設置3個重復，定量分析結果由LightCyeler 480分析軟件自動分析。

1.4 統計分析

通過實時熒光定量PCR獲得目的基因和持家基因的CT值，采用2-ΔΔCT法計算TLR4基因的相對表達量。利用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，結果以柱狀圖顯示各時期不同階段的基因差異表達。

2 結果與分析

2.1 綿羊TLR4基因的克隆

利用GenBank中綿羊TLR4基因mRNA序列（XM_012111214.1），以綿羊子宮內膜組織cDNA 第一鏈為模板，經擴增和測序，獲得一條長度為165 bp的目的片段（圖1）及長度為149 bp的GAPDH內參基因片段（圖2）。PCR產物送測序公司測序，是所設計的目的基因片段。

2.2 綿羊TLR4基因的組織表達譜分析

運用半定量RT-PCR檢測方法，以綿羊GAPDH作為內參基因，檢測了TLR4目的基因在妊娠21 d母羊不同組織中的差異表達情況。由圖3、圖4可知，TLR4基因在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體中出現高表達，在肝臟、小腸、肌肉中出現低表達，而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達。

2.3 綿羊TLR4目的基因和GAPDH內參基因擴增曲線和熔解曲線分析

由圖5、圖6可知，實時熒光定量RT-PCR擴增曲線顯示，擴增產物的“S”形曲線都很清晰，檢測到的熒光信號峰值較高，TLR4目的基因和GAPDH內參基因的指數擴增期和平臺期也很明顯，線性范圍也很廣。TLR4基因從22～34個循環可檢測出，GAPDH從19～31個循環可檢測出，表現出較為完整的擴增曲線。熔解曲線分析表明，熔解曲線呈現單峰，說明擴增產物單一，其熒光強度均來源于特異性的擴增產物，而沒有產生非特異性擴增和引物二聚體，說明擴增產物特異性良好，結果具有很好的代表性。

2.4 綿羊TLR4基因在不同品種綿羊卵泡期和黃體期母羊子宮內膜的表達分析

本試驗旨在研究TLR4基因在綿羊胚胎附植期和發情周期子宮內膜中mRNA表達情況，采用了實時熒光定量 RT-PCR 方法，以綿羊GAPDH作為內參基因對胚胎附植期和發情周期各不同階段的子宮內膜TLR4基因表達水平進行了跟蹤檢測。由圖7可知，TLR4基因在附植期不同階段懷孕母羊子宮內膜組織中，17 d表達水平最低，25 d表達水平最高;9～25 d TLR4基因表達呈現出先降低后升高的趨勢，胚胎附植期不同階段的表達水平差異顯著（P<0.05）。

由圖8、圖9可知，無論是細毛羊還是湖羊，TLR4基因在其子宮組織中的表達水平均是黃體期>卵泡期，且差異顯著（P<0.05），但不同品種綿羊之間的表達差異并不明顯。

3 討論

關于人和小鼠的TLR4的研究報道比較多，表明了其在免疫、疾病和感染等方面發揮著重要的作用[9-11]，但在有關綿羊繁殖方面的研究較少，而且對TLR4免疫分子機制研究也相對較少。

本試驗首次采用半定量RT-PCR方法對妊娠21 d母羊全身組織進行表達譜分析研究，結果顯示TLR4基因在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體等與繁殖和免疫相關的組織器官中呈現高表達，在肝臟、小腸、肌肉中呈現低表達，而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達。2011年聶奎等在文獻報道中稱在兔的胸腺、骨髓、淋巴結、脾臟等組織中均檢測到TLR4 mRNA的表達[12]。周作勇等研究發現，TLR4 mRNA在雛雞胸腺、腸道、肌肉和脾臟中的轉錄水平沒有顯著性的差異[13]。而2006年Higgs等在文章中報道，TLR4主要在雞的骨髓中表達，而在脾臟、肝臟、小腸、法氏囊和盲腸等組織中表達水平低或者不表達[14]。同樣，Alvarez等在豬的組織器官中研究發現，TLR4 mRNA在其胸腺和淋巴結中表達量較高，在其他組織中表達量較低[15]。Nishimura等針對胎兒和成人的組織以及細胞樣品進行了采集研究，結果表明TLR4 mRNA在脾臟表達量最高[16]。綜上結果，不僅說明了TLR4 mRNA表達具有組織特異性，而且在繁殖和免疫器官中TLR4的高表達也暗示了該受體可能與繁殖及免疫機制存在某種關聯。

胚胎和子宮內膜在時空上互相辨認、容受并產生黏附性關聯，是哺乳動物胚胎附植成功與否的重要環節，在此過程當中涉及到了相互之間的復雜分子調控進程。在反芻動物的胚胎附植過程當中，囊胚在附植期會出現顯著性的形態學轉變。通常情況下，綿羊囊胚在配種發育8 d后從透明帶中孵出，呈直徑約200 μm球形，11 d起由球形變成管形;發育14 d時變成纖絲狀，到17 d時達到25 cm以上[17]。同時，囊胚的伸長也是附植開始的顯著性標志，滋養層細胞的快速伸長對維持妊娠非常重要，它可以使孕體盡快與子宮內膜產生黏附且抑制前列腺素的分泌。綿羊妊娠14 d胚胎滋養層絨毛與子宮內膜上皮細胞開始接觸，并在妊娠16～18 d產生黏附，絨毛不停伸長而呈現出血管，妊娠30 d時與子宮阜的組織構成“母包子型”胎盤[18]。

本試驗針對細毛羊胚胎附植期5 個不同階段的母羊子宮內膜進行了熒光定量RT-PCR檢測，結果發現妊娠9～17 d母羊子宮內膜TLR4基因的表達水平逐漸下降，且在17 d胚胎附植點的表達量最低。在此過程中，雌激素的致敏和孕激素的生理作用是子宮產生生理變化的主要因素。孕激素促進子宮內膜腺體的分泌;雌激素除促使子宮內膜增生外，還促進了子宮釋放蛋白水解酶，繼而促使透明帶溶解和滋養層細胞增生，滋養層漸漸浸入子宮上皮和基質層，進而引起胚胎的附植。TLR4信號通路中的重要調節因子NF-κB被證實可調節妊娠相關組織中促炎癥因子（IL-1β、TNF-α等）以及前列腺素的產量，繼而通過IL-1β來促進子宮頸的成熟與擴張，通過前列腺素、E2來刺激分娩[19]。所以，TLR4受體mRNA表達在附植點17 d降低之后，至25 d mRNA的表達量又逐漸升高，且表現出顯著性差異。

在動物發情周期中，隨著動物生殖器官（如卵巢和子宮內膜）的生理變化以及損傷再修復過程，TLR4的表達量會有顯著變化[20]。因為性激素不僅可以調節子宮內膜的結構和組織形態，而且還可以調節免疫細胞在子宮內膜的匯集和分布。例如，人類子宮中發現大量的NK細胞，并且隨著發情周期變化NK細胞以不斷增加的趨勢分布于子宮內膜[21-22]。已證實在發情周期TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9和TLR10基因在子宮內膜中的表達變化[23]。雌激素水平在生殖期相對于分泌期較高，同時孕酮水平在分泌期相對于生殖期要高。這表明，在雌性哺乳動物生殖系統特別是在子宮內膜中，雌激素對TLRs的表達起抑制作用，而孕酮對TLRs表達起促進作用，Jorgenson等發現了TLR3在子宮內膜組織中的表達有周期依賴性[24]。

本試驗對細毛羊和湖羊的卵泡期和黃體期研究發現，TLR4基因在其子宮內膜組織中的表達水平均出現黃體期>卵泡期。這與Jorgenson等的研究結果[24]一致。在卵泡期雌激素水平逐漸升高至最大，促進子宮內膜增厚，子宮頸上皮生長、增高呈高柱狀，增強深層腺體分泌活動，黏液分泌量也逐漸增多，子宮肌收縮活動也逐漸增強，卵泡逐漸發育增大。而在黃體期，大量的孕激素分泌，作用于子宮，內膜血管增生，子宮變粗，腺體分泌活動性加強，子宮肌收縮受到抑制。所以，這一研究結果也得到了理論知識的支撐。

綜上試驗，本研究得出TLR4基因在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體等免疫組織器官中呈現出高表達水平，說明了該受體基因在組織中的表達特異性。其mRNA在綿羊不同生理狀態下子宮內膜組織中的表達呈現動態時空特征，初步揭示TLR4受體在哺乳動物繁殖免疫調節過程中發揮著重要作用。

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