混合物料干濕厭氧發酵特性及菌群結構

鄭訊濤　王樂樂　張寓涵　張洋洋　潘云霞

摘要：厭氧發酵是解決秸稈和畜禽糞等農業廢棄物污染的重要途徑，為實現秸稈和牛糞的資源化利用，研究稻稈和牛糞混合物料干、濕厭氧發酵特性，并對混合物料發酵前后的菌群結構進行分析。結果表明，稻稈與牛糞混合物料干、濕發酵的揮發性脂肪酸（VFAs）均以乙酸和丙酸為主，發酵pH值均在5.6～7.7之間變化，濕發酵的總固體濃度（total solid，簡稱TS）累積產甲烷量（63.8 mL/g）較干發酵（36.9 mL/g）提高73.90%，發酵前后菌群結構發生較大變化，細菌的優勢菌群由消化鏈球菌（Peptostreptococcaceae）、瘤胃菌（Ruminococcaceae）、梭菌（Clostridiaceae.1）和理研菌（Rikenellaceae）轉變為普雷沃氏菌（Prevotellaceae）、毛螺菌（Lachnospiraceae）和互養菌（Synergistaceae），古菌的優勢菌群由甲烷桿菌（Methanobacteriaceae）和甲烷球菌（Methanosarcinaceae）轉變為以乙酸代謝為主的甲烷球菌（Methanosarcinaceae）。

關鍵詞：稻稈;牛糞;混合物料;厭氧發酵;特性;菌群結構

中圖分類號： X71;S188+.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0238-04

我國每年產生的秸稈和畜禽糞達到8.00、32.64億t[1]，如果未能妥善處理，會對生態環境造成巨大危害。以秸稈與畜禽糞混合為底物進行厭氧發酵生產沼氣，既可解決農村畜禽糞處理原料不足問題，也可緩解環境污染壓力，還能實現清潔能源的生產[2-3]。目前秸稈與畜禽糞的厭氧發酵多采用濕式厭氧發酵形式，該方法耗水量大，沼液產生量多[4]，后續處理不便。干發酵由于其發酵過程需水量較少，發酵后無沼液產生、沼渣可用于直接制有機肥、減少二次污染等優點受到普遍關注[5-6];但單純的畜禽糞干發酵，由于物料氨態氮含量高，發酵系統易產生氨中毒現象[7-8]，而且物料較差的透氣性和傳質性能也使發酵系統效率較低[9]。單一秸稈干發酵仍須添加額外氮源以防止酸化現象[10];將畜禽糞與秸稈混合進行干發酵既可改善發酵體系中的C/N平衡，降低發酵過程中氨抑制的風險，又可通過秸稈的疏松結構改善原料間的接觸面、增強物料的傳質性能。在發酵中微生物菌群對沼氣的生產發揮了重要作用[11-12]，分析厭氧發酵過程中微生物菌群的結構及代謝產物的變化有助于了解發酵系統的運行狀態，便于改進發酵工藝，提高發酵系統的厭氧消化效率及產氣量。為此，本研究將鮮牛糞與稻稈按比例混合，研究混合物料高含固率的濕發酵總固體濃度（total solid，簡稱TS）（TS=10%）與干發酵（TS=25%）的厭氧消化特性，并對發酵潛力好的一組細菌和古菌微生物菌群進行16S rRNA高通量測序，研究發酵前后微生物菌群的結構及功能變化，以期通過厭氧發酵途徑為秸稈和畜禽糞的資源化利用提供可靠技術支持。

1材料與方法

試驗于2016年11月至2017年3月在西南大學廢棄物資源化利用實驗室進行。

1.1試驗材料

鮮牛糞取自重慶市北碚區某奶牛養殖場;稻稈取自重慶市北碚區歇馬鎮某稻田，稻稈已在田間自然風干半年，試驗前去掉稻穗，并將稻稈剪至1～2 cm的小段。試驗材料的理化性質如表1所示。

1.2試驗裝置與試驗方法

試驗采用自制的發酵裝置（圖1），主要由2.5 L的發酵瓶、加熱與溫控裝置、循環泵、集氣量筒、導氣管等組成。發酵罐溫度通過外部儲水箱水加熱后泵送至發酵罐保溫層，以保持恒溫（35±1） ℃，產氣量由排水法收集。試驗設置干發酵組和濕發酵組，2組試驗發酵原料總質量均為800 g，總固體濃度分別為10%、25%，試驗中稻稈與鮮牛糞按照干物質比 1 ∶1 添加，厭氧發酵前先通入5 min氮氣以除去發酵瓶內的氧氣。

1.3分析方法

總固體含量采用烘干法測定;揮發性固體（volatile solid，簡稱VS）采用馬弗爐灼燒法測定[13];pH值采用精密pH計（Sartorius-10型）測定;揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，簡稱VFAs）采用高效液相色譜儀（LC2010）測定;纖維素酶活性采用DNS比色法測定[14];酶活性單位定義：1 mL發酵液在一定pH值和溫度下在1 min內催化底物生成1 μmol的葡萄糖為1個酶活單位，用U表示;總產氣量采用排水法測定，甲烷含量采用GC9720型氣相色譜儀進行分析測定[15]。

1.4微生物多樣性的測定

1.4.1總DNA的提取

取搖勻后的1.5 mL發酵液，過濾，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，剩余沉淀物用于總DNA提取?？侱NA的提取按照試劑盒（OMEGA Soil DNA Kit）的說明書進行，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分子大小判斷，并利用紫外分光光度計對DNA進行定量分析。

1.4.2微生物菌群結構檢測

試驗選用長度約為250 bp的細菌16S rRNA基因高度可變的V4區和長度為420 bp的古菌16S rRNA基因高度可變的V4V5區測序。PCR擴增選用細菌16S rDNA V4區特異性引物，520F（5′-barcode+[JP9]AYTGGGYDTAAAGNG-3′）、802R（5′-[JP9]TACNVGGGTATCTAATCC-3′）;古菌進行PCR擴增選用的引物為519F（5′-[JP9]CAGCCGCCGCGGTAA-3′）、915R（5′-[JP9]GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′）。PCR反應體系（25 μL）為：0.25 μL Q5 high-fidelity DNA聚合酶，5 μL 5×Reaction Buffer，5 μL 5×High GC Buffer，2 μL dNTP（10 mmol/L），2 μL DNA模板，1 μL正向引物（10 μmol/L），1 μL 反向引物（10 μmol/L），加水補足至 25 μL。PCR擴增程序：98 ℃預變性30 s;98 ℃變性15 s，50 ℃ 退火30 s;72 ℃延伸30 s，25個循環;72 ℃延伸5 min。將擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目標片段采用上海百賽生物技術股份有限公司（Axygen）的凝膠回收試劑盒進行回收。文庫的制備和高通量測序由測序公司進行。

2結果與分析

2.1干、濕發酵過程中VFAs與pH值的變化

pH值和VFAs對厭氧消化產沼氣有重要影響[16-17]。由圖2可知，在稻稈與牛糞混合物料的干、濕發酵中，VFAs與pH值的變化存在較大差異。干發酵的pH值在發酵10 d時降至最低，隨后處于逐漸升高狀態，而VFAs達到峰值的時間滯后于pH值降低的時間，但濕發酵的pH值降低與VFAs的升高同步。在稻桿與牛糞混合物料的干、濕發酵中，總VFAs均以乙酸和丙酸為主，甲酸和丁酸的含量相對較少，且乙酸含量隨發酵時間均呈先上升后下降的趨勢。在干發酵中，乙酸的平均濃度占總VFAs的44.4%，明顯高于濕發酵的30.5%，丙酸的平均濃度為2.85 g/L，高于產甲烷菌對丙酸的耐受濃度1.0 g/L[18]，所以在干發酵后期出現了丙酸積累。濕發酵進行到40 d時，丙酸含量累積到5.04 g/L，遠超過產甲烷菌的耐受能力，但由于此時甲酸、乙酸、丁酸濃度很低，加之濕發酵較好的傳質能力，產甲烷菌能夠間接利用丙酸進行代謝[19]，使丙酸含量迅速降低，所以雖然發酵結束丙酸含量占總VFAs的90%，但系統并沒有出現酸化現象。

2.2干、濕發酵過程中酶活性的變化

混合發酵物料中含有半纖維素、纖維素、木質素，纖維素酶活性在一定程度上反映了發酵底物的降解效率。由圖3可知，復合酶系的3種酶均參與混合物料的發酵水解，均呈先升高后降低的趨勢，并且在3種酶中酶活性最高的是內切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶，外切葡聚糖酶雖在發酵中期有較大活性，但低于內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活。干、濕發酵的濾紙總酶活性在發酵的前20 d整體呈上升趨勢，并在20 d時達到峰值1.68、1.40 U/TS，隨后整體呈下降趨勢。

2.3干、濕發酵過程中日產氣量與累積產氣量的變化

由圖4-a可知，混合物料干發酵與濕發酵在最初5 d均經歷了1個小的產氣高峰（320、415 mL），但此時氣體成分中甲烷含量均較低（圖4-b）。濕發酵在30、41 d時出現了2次產氣高峰，產氣量分別達到765、635 mL，干發酵在28 d時產氣量開始增加，43 d時達到產氣高峰909 mL，之后逐漸下降，發酵結束時，濕發酵累積TS甲烷產量為63.8 mL/g，較干發酵的甲烷產量高73.2%（圖4-b）。為此，對濕發酵的微生物菌群結構進行分析。

2.4混合物料濕發酵中微生物菌群分布

由圖5可知，厭氧發酵前后，細菌和古菌在菌群豐度上發生了較大的變化。在發酵初期（發酵5 d），細菌中消化鏈球菌（Peptostreptococcaceae）、瘤胃菌（Ruminococcaceae）、梭菌（Clostridiaceae.1）、理研菌（Rikenellaceae）是優勢菌群，分別占27.6%、15.8%、12.6%、6.7%;經厭氧消化后，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）、克里斯騰森菌（Christensenellaceae）、毛螺菌（Lachnospiraceae）、互養菌（Synergistaceae）較發酵初期分別提高16.4%、13%、7%、5.8%，成為產氣高峰（發酵40 d）的優勢細菌菌群。古菌中，發酵初期（發酵5 d）的產甲烷菌主要有甲烷桿菌（Methanobacteriaceae）與甲烷球菌（Methanosarcinaceae），它們的豐度差別不大，分別占菌群總數的 16.2%、17.5%，但發酵進行至產氣高峰（發酵40 d）后，甲烷球菌成為主要的優勢菌群，其豐度達到33.8%，而甲烷桿菌降至9.2%。

3討論

糖類是厭氧發酵過程中的重要中間產物，是多數微生物的營養物質。在發酵底物主要為木質纖維素時，糖類的產生主[CM（25]要依賴于微生物分泌的纖維素酶對木質纖維素的水解作用。試驗中，發酵前期纖維素酶活性逐漸升高，通過菌群檢測發現能夠分泌纖維素酶的瘤胃菌（Ruminococcaceae）[20-21]、能夠利用木聚糖和淀粉等物質的普雷沃氏菌（Prevotellaceae）[22]、克里斯騰森菌（Christensenellaceae）、毛螺菌（Lachnospiraceae）及互養菌（Synergistaceae）成為優勢菌群，同時，能夠通過糖酵解平臺水解產生VFAs的梭菌（Clostridiaceae.1）和理研菌（Rikenellaceae）也是優勢菌群[23-24]，因此發酵前期VFAs的含量隨纖維素酶活性升高而增加。在發酵中后期，利用H2/CO2、甲酸鹽、2-丙醇/CO2、2- 丁醇/CO2的甲烷桿菌[25]豐度大幅下降，利用乙酸和甲醇等營養物質[26]的甲烷球菌成為優勢菌群，VFAs中的乙酸被甲烷球菌利用產生甲烷，所以此時發酵系統中，乙酸含量幾乎為0，而甲烷含量逐漸增加。研究表明，只有當發酵系統內的氫分壓穩定在 0.1～10.1 Pa范圍內時，丙酸的降解才會發生[27]，但發酵后期氫養型甲烷短桿菌的豐度大幅下降，不能維持系統內較低的氫分壓，這可能是丙酸積累的重要原因。

4結論

稻稈與牛糞混合物料在干、濕發酵過程中，VFAs均以乙酸和丙酸為主，甲酸和丁酸含量相對較低，pH值為5.6～7.7，發酵系統沒有出現酸化現象，濕發酵的累積TS甲烷產量（63.8 mL/g）較干發酵（36.9 mL/g）提高72.90%。稻稈與牛糞混合物料的濕發酵以甲烷球菌（Methanosarcinaceae）的乙酸代謝為主，發酵前后，微生物菌群結構發生較大變化。發酵初期，細菌菌群以消化鏈球菌（Peptostreptococcaceae）、瘤胃菌（Ruminococcaceae）、梭菌（Clostridiaceae.1）和理研菌（Rikenellaceae）為主，甲烷桿菌（Methanobacteriaceae）與甲烷球菌（Methanosarcinaceae）為古菌優勢菌群，厭氧發酵后，細菌優勢菌群轉變為普雷沃氏菌（Prevotellaceae）、毛螺菌（Lachnospiraceae）和互養菌（Synergistaceae），古菌則以甲烷球菌（Methanosarcinaceae）為主。

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