10份貴州常用玉米自交系絲黑穗病抗性鑒定及遺傳多樣性分析

譚康 李春紅 楊梅 申濤 邱紅波

摘要：【目的】對貴州常用玉米自交系進行絲黑穗病抗性鑒定、主要農藝性狀評價及SSR遺傳多樣性分析，為貴州玉米的抗絲黑穗病基因挖掘及優質抗性種質資源創建提供參考依據?！痉椒ā恳?0份貴州常用玉米自交系材料為研究對象，于2016—2017年分別在貴州安順市平壩實驗基地及貴陽市花溪區貴州大學魚塘教學試驗場進行絲黑穗病抗性鑒定;采用136對條帶清晰、重復性好的SSR分子標記對供試材料進行PCR擴增檢測，并運用POPGENE 32和NTSYS-2.10e進行遺傳多樣性和聚類分析?！窘Y果】連續兩年兩地的玉米絲黑穗病抗性鑒定結果表明，自交系T32和齊319表現為穩定高抗，感病率為0;自交系J51和J106表現為高感，平均感病率分別為64.18%和48.62%，其余6個自交系表現為感病。10份貴州常用玉米自交系材料在貴州地區均能正常成熟，其中以T32的綜合表現較突出，為貴州優勢種質材料，J51、J106和雙M9次之，齊319的表現相對較差。136對SSR分子標記從10份貴州常用玉米自交系材料中共檢測到567個等位基因，平均為4.17個;Neis基因多樣性指數（H）為0.180～0.500，平均為0.328;多態性信息量（PIC）為0.150～0.920，平均為0.656;多態性最好的SSR分子標記為umc1795。以相似系數0.658為界，10份貴州常用玉米自交系可劃分為三大類：類群Ⅰ包括蘇11、T32、S37和雙M9，均具有熱帶血緣;類群Ⅱ包括齊319、J106、HC、鄭58和QL16，均具有溫帶血緣;類群Ⅲ為貴州地方種質J51?！窘Y論】貴州常用玉米自交系材料具有較廣泛的遺傳基礎，可滿足玉米育種對親本遺傳差異的基本要求。尤其是自交系T32高抗玉米絲黑穗病且在貴州山區具有良好的適應性，為熱帶血緣Suwan選系，明顯區別于改良Reid選系、先鋒選系、美國雜交種選系及貴州地方種質，可優先用于貴州地區抗絲黑穗病基因發掘、雜交種改良及優良抗性種質資源創建。

關鍵詞： 玉米;自交系;絲黑穗病;SSR分子標記;抗性鑒定;貴州

中圖分類號： S513.024? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）11-2384-08

Identification of head smut resistance and analysis of genetic diversity of 10 commonly used maize inbred lines in Guizhou

TAN Kang， LI Chun-hong， YANG Mei， SHEN Tao， QIU Hong-bo*

（College of Agriculture， Guizhou University，Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】To analyze the identification of head smut resistance， evaluation of main agronomic traits and analysis of SSR genetic diversity of common maize inbred lines in Guizhou， and to provide a reference basis for head smut resistance gene mining and breeding of high-quality resistance germplasm resources of maize in Guizhou. 【Method】Taking 10 copies of Guizhou common maize inbred lines as research objects， the resistance identification test for head smut was performed at the Pingba Experimental Base in Anshun， Guizhou， and the fish pond teaching experimental field of Guizhou University， Huaxi District， Guiyang from 2016 to 2017. A total of 136 pairs of SSR molecular markers with clear and reproducible bands were used for PCR amplification of test materials. Genetic diversity and cluster analysis were performed by POPGENE 32 and NTSYS-2.10e. 【Result】The identification of head smut resistance in two places for two consecutive years showed that inbred lines T32 and Qi 319 showed stable high resistance with a susceptibility rate of 0; inbred lines J51 and J106 showed high susceptibility with susceptibility rates of 64.18% and 48.62%， and the other six inbred lines showed susceptibility. The analysis of main agronomic traits showed that all of the tested materials could grow in Guizhou mountainous area， among which inbred line T32 was the best， followed by J51， J106 and Shuang M9， and Qi 319 was the worst. Genetic diversity analysis showed that 567 alleles were detected in 10 maize materials with 136 pairs of SSR markers， averaging 4.17 alleles， Neis gene diversity index（H） was 0.328 on average， ranging from 0.180 to 0.500. Polymorphism information quantity （PIC） was 0.656 on average， ranging from 0.150 to 0.920. The umc1795 polymorphism was the best SSR marker. Taking the similarity coefficient of 0.658 as the boundary， 10 copies of Guizhou common maize inbred lines could be divided into three major groups：Group I included Su 11， T32， S37 and Shuang M9， all of which had tropical genetics;group II included Qi 319， J106， HC， Zheng 58 and QL16，they had temperate zone gene-tics; and group III was Guizhou local germplasm J51. 【Conclusion】The common maize inbred line materials in Guizhou have a broad genetic basis， which can meet the basic requirements for genetic differences of parents in maize breeding;The inbred line T32 is highly resistant to maize head smut and has good adaptability in the mountainous areas of Guizhou. It is a tropical Suwan line， which is different from the improved Reid line， Pioneer line， American hybrid line and Guizhou local germplasm. It can be preferentially used for the identification of head smut resistance genes， improvement of hybrids and creation of excellent resistant germplasm resources in Guizhou.

Key words： maize; inbred lines; head smut; SSR molecular marker; resistance identification; Guizhou

0 引言

【研究意義】玉米在我國貴州已有300多年的種植歷史，是貴州重要的口糧、飼料及輕工業原料（郭向陽等，2015）。玉米絲黑穗病是由絲軸黑粉菌[Sporisorium reilianum（Kühn） Landon et Full]引起的一種全球性玉米病害，也是我國春玉米主要病害之一（白金鎧，1997），自1919年在我國東北首次報道以來，病情不斷蔓延升級，在我國東北、西南、甘肅和山西等地相繼暴發成災（栗建枝等，2002;張文天和王保進，2002;賀字典等，2005;黃劍秋，2005），導致當地玉米產量銳減。培育和利用適宜本地種植的抗病品種是防治玉米絲黑穗病最根本和最有效的方法，而對玉米種質資源的絲黑穗病抗性鑒定及抗性種質挖掘和利用是抗病育種的關鍵?！厩叭搜芯窟M展】至今，國內外學者對玉米絲黑穗病抗性種質的鑒定累計達7000余份（馬沛卿等，1997;宋淑云等，2000;高潔等，2006;郭滿庫等，2007），且鑒定結果顯示大部分常用自交系感或高感絲黑穗病，即抗性種質資源嚴重匱乏（馬秉元等，1997;王連生等，2001;王振華等，2004;孟劍等，2015）。有關貴州常用玉米種質的絲黑穗病抗性研究，劉紅梅等（2006）、柏光曉等（2007）從500多份貴州省內保存的玉米種質資源中僅篩選出6份高抗材料，表明貴州地區抗絲黑穗病玉米種質資源也非常匱乏。SSR分子標記因具有單堿基高分辨率、可檢測等位基因、所需DNA樣本量少和重復性好等優點（Blair et al.，2011;周麗霞等，2017），已廣泛應用于植物遺傳多樣性分析及種質資源鑒定等研究領域。胡萍等（2012）利用19對玉米SSR分子標記將108份貴州地方玉米種質分為五大類群，揭示了貴州地區玉米種質遺傳基礎較廣泛，同時為地方種質合理利用提供了參考;石海春等（2014）采用形態標記和SSR分子標記分別對82份玉米自交系進行聚類分析，結果顯示，形態標記將供試材料劃分為六大類，而SSR分子標記將供試材料劃分為七大類，通過與供試材料系譜來源進行對比分析，證實SSR分子標記在種質資源鑒定及遺傳多樣性分析方面具有絕對優勢;李世風等（2016）采用全自動DNA分析儀熒光SSR-PCR技術，以模型結構聚類法和遺傳距離聚類法對甘肅省部分骨干玉米自交系進行聚類分析，結果發現兩種聚類方法所得結果與材料系譜信息基本一致;劉海忠等（2018）基于SSR分子標記技術將120份美國和塞爾維亞玉米自交系及2份中國玉米自交系聚類細分為九大主要類群，為歐美優異種質的融入及合理利用提供了參考依據?！颈狙芯壳腥朦c】貴州地區抗絲黑穗病玉米種質資源匱乏，且至今鮮見采用SSR分子標記進行抗性種質資源鑒定的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以10份貴州常用玉米自交系材料為研究對象，對其進行絲黑穗抗性鑒定、主要農藝性狀評價及SSR遺傳多樣性分析，旨在為貴州常用玉米的抗絲黑穗病基因挖掘及優質抗性種質資源創建提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的10份貴州常用玉米自交系材料（表1）均由貴州大學玉米研究所提供，以穩定高感品種渝糯7號為對照。Easy Taq DNA Polymerase for PAGE、High Pure dNTPs和N，N-亞甲雙丙烯酰胺等主要試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要設備儀器：T100TM PCR儀（BIO-RAD，美國）、高速冷凍離心機（Eppendorf 5810R，德國）、移液器（Eppendorf，德國）和電泳儀（DYY-10C，北京六一生物科技有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 絲黑穗病接種及鑒定方法 從前一年典型的玉米絲黑穗病感病植株上采集病癭，避光陰干后置于布袋內，以備來年鑒定使用。2016—2017年分別在貴州安順市平壩實驗基地（簡稱平壩基地）及貴陽市花溪區貴州大學魚塘教學試驗場（簡稱花溪基地）進行接種鑒定。采用育苗盤內菌土育苗完成病菌侵染，育苗前3 d將備用病癭上的菌粉剝離，過40目銅篩后按0.1%比例與濕潤細土充分混合制成菌土，育苗盤規格50穴/盤，每份自交系育苗100穴，每穴3粒種子，用普通細土將育苗盤填充至4/5處，播種后覆蓋菌土。待材料長至3～4片葉時，帶菌土移栽至試驗地，采用隨機區組設計，每區2行，3次重復，共30個小區，行長5 m，行距70 cm，株距25 cm，每行11穴，每穴保留2株。

絲黑穗發病情況在玉米進入乳熟末期時進行調查。逐區逐株記載各小區的總株數和發病株數，統計感病率[感病率（%）=發病株數/調查總株數×100]。根據感病率進行抗性分級：感病率在0～1.00%為高抗（HR）;1.10%～5.00%為抗?。≧）;5.10%～10.00%為中抗（MR）;10.10%～40.00%為感?。⊿）;40.10%～100.00%為高感（HS）。

1. 2. 2 田間種植及農藝性狀調查方法 2018年將10份玉米自交系種于貴陽市花溪區標準山地。采用隨機區組設計，每區2行，3次重復，共30個小區，行長5 m，行距70 cm，株距25 cm，每行11穴，每穴保留2株，所有植株均嚴格套袋自交。玉米成熟期從每小區隨機選取10株植株測量株高、雄穗長、穗位高、莖粗和葉面積;生理成熟期從每小區隨機選取已成功套袋自交的10株植株收獲測產，并獲取穗長、禿尖長、穗粗、穗重、穗行數、行粒數和百粒重等產量相關性狀。

1. 2. 3 DNA提取 玉米苗期取幼嫩葉0.2 g于液氮中研磨，參照Saghai-Maroof等（1994）改良的CTAB法提取總DNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量后用超純水稀釋，-20 ℃保存備用。

1. 2. 4 SSR分析 選用均勻分布于玉米10個連鎖群的136對條帶清晰、重復性好的SSR分子標記，標記序列信息來源于玉米基因組數據庫（http：//www.maizegdb.org/），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系10.0 μL：10×Buffer（Mg2+） 1.2 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各1.0 μL，dNTPs 0.2 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，DNA模板（40 ng/μL）2.0 μL，ddH2O 4.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物采用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，參考Wang等（2007）的方法進行銀染并觀察拍照。

1. 3 統計分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0進行統計分析。擴增結果保留主要帶型，根據其主要帶型區間片段大小對應分子量依次編號為1、2、3、4…n。在相同遷移率位置上，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，統計[0，1]矩陣。應用POPGENE 32計算等位基因數（Na）、Neis基因多樣性指數（H）及多態性信息指數（PIC），PIC=1-∑fi2，其中fi為i位點的基因頻率;并按非加權配對算數平均法（UPGMA），采用NTSYS-2.10e進行聚類分析。

2 結果與分析

2. 1 10份貴州常用玉米自交系絲黑穗病抗性鑒定結果

10份貴州常用玉米自交系材料的抗性鑒定結果（表2）表明，高抗自交系有2份（齊319和T32），在連續兩年兩地的鑒定中其感病率均為0，說明這兩個自交系在貴州山區高抗絲黑穗病且十分穩定;感病自交系有6份（HC、蘇11、QL16、S37、雙M9和鄭58），平均感病率為10.39%～36.94%，其中鄭58的感病率均在10.00%左右，處于中抗與感病之間;高感自交系2份（J51和J106），平均感病率分別為64.18%和48.62%，其中J51在連續兩年兩地的鑒定中感病率均明顯高于其他材料，為絲黑穗病高感材料。除HC、S37、雙M9和鄭58外，其他材料在兩年兩地的抗性鑒定結果基本一致。此外，10份貴州常用玉米自交系材料（除高抗自交系齊319和T32外）2016年在平壩基地的發病情況均高于花溪基地，可能是該試驗點具備誘發玉米絲黑穗病所需的溫度、濕度等條件，如低溫干旱可延長種子幼芽期，進而提高侵染率。

2. 2 10份貴州常用玉米自交系主要農藝性狀表現

2. 2. 1 株型性狀 如表3所示，10份貴州常用玉米自交系材料的株高為92.20～170.20 cm，變異系數為20.70%;雄穗長為21.70～33.90 cm，變異系數為14.56%;穗位高為19.90～69.67 cm，變異系數為44.13%，說明10份自交系材料在穗位高上變異較大，具有豐富的遺傳變異基礎;平均莖粗為9.66～14.92 mm，變異系數為14.87%，其中J51和T32均超過14.00 mm，說明這2份自交系材料莖稈粗壯，可能在礦質營養吸收及抗倒伏能力上具有良好表現;葉面積為159.60～412.58 cm2，變異系數為30.64%，其中T32的葉面積最大，表明其具備較強的光接收能力，能為玉米光合作用提供光源基礎。

2. 2. 2 穗部性狀 10份貴州常用玉米自交系材料中，穗長為8.70～12.65 cm，變異系數為12.48%，J51、雙M9、T32和QL16等4份自交系材料的穗長均在11.00 cm以上;穗粗為3.14～7.55 cm，變異系數為36.08%，大部分材料分布在3.00～4.00 cm;穗重為20.50～60.67 g，變異系數為34.45%，以T32和J51較重，分別為60.67和55.00 g;穗行數變化范圍在8.00～14.50行，變異系數為17.90%;百粒重變幅為17.00～30.80 g，變異系數為17.30%，以T32和QL16的百粒重較重，約30.00 g，其他材料主要分布在21.00～24.00 g。

綜合株型及穗部農藝性狀分析發現，10份貴州常用玉米自交系材料在貴州地區均能正常成熟，其中以T32的綜合表現較突出，為貴州優勢種質材料，J51、J106和雙M9次之，齊319的表現相對較差。

2. 3 SSR分子標記分析結果

對PCR擴增條帶（圖1）進行統計分析，結果如表4所示。以136對SSR引物對10份貴州常用玉米自交系材料進行PCR擴增，共檢測到567個等位基因，每對SSR引物檢測到2～9個等位基因，平均為4.17個。Neis基因多樣性指數（H）變幅為0.180～0.500，平均為0.328;對應的多態性信息量（PIC）變幅為0.150～0.920，平均為0.656。其中多態性最好的SSR分子標記為umc1795。

2. 4 10份貴州常用玉米自交系的聚類分析結果

采用NTSYS-2.10e對10份貴州常用玉米自交系材料進行聚類分析，結果如圖2所示。以相似系數0.658為界，10份貴州常用玉米自交系可劃分為三大類，類群Ⅰ包括蘇11、T32、S37和雙M9，均具有熱帶血緣，屬于泰國Suwan種質及墨西哥墨黃9號選系，且在相似系數0.698處，蘇11、T32和雙M9聚為一個亞類。類群Ⅱ包含先鋒選系齊319、美國雜交種選系J106及改良Reid類群下的HC、鄭58和QL16，均具有溫帶血緣，且在相似系數0.671處，同為Reid改良系的HC、鄭58和QL16聚為一個亞類，而齊319和J106聚為另一亞類。類群Ⅲ為貴州地方種質J51，其明顯區別于其他自交系材料，與具有溫帶血緣的美國種質較接近?？梢?，聚類分析結果與種質來源基本吻合，也表明這10份貴州常用玉米自交系材料具有較廣泛的遺傳基礎，可滿足玉米育種對親本遺傳差異的基本要求。

3 討論

本研究結果表明，對照品種渝糯7號在連續兩年兩地的感病率均在90.00%左右，表現為高感，說明抗性鑒定試驗的環境及接種處理的各環節均滿足玉米絲黑穗病抗性鑒定的需求，鑒定結果可靠。在本研究中，自交系HC和鄭58的抗性鑒定為S，平均感病率分別為36.94%和10.39%，與郭滿庫等（2007）的鑒定結果存在差異，即HC的抗性鑒定為R（感病率4.1%），鄭58的抗性鑒定為S（感病率為16.7%）;但對于自交系T32和齊319的抗性鑒定，與郭滿庫等（2007）、胡安龍和楊再能（2012）的鑒定結果完全一致，感病率均為0，抗性鑒定為HR。造成抗性鑒定結果差異的原因可能是抗性鑒定點環境及接種方法、田間種植管理等因素不同所致，郭滿庫等（2007）、胡安龍和楊再能（2012）采用田間直接接種法，而本研究是采用育苗盤菌土接種病菌后移栽，但具體原因有待進一步探究。

Suwan種質具有高產穩產、適應性廣及特殊抗逆性、抗病蟲性等特點（郭向陽等，2015）。本研究中Suwan選系T32高抗玉米絲黑穗病，株型、產量等相關性狀表現優良，符合Suwan種質高抗病性及廣適應性的特點，但同為Suwan種質的蘇11和S37，其農藝性狀表現不佳且易感絲黑穗病。究其原因可能是Suwan種質過于龐雜，Suwan選系主要來源于Suwan 1、Suwan 3和Suwan 5等3個群體，且育種者不斷對Suwan種質進行改良選育以滿足不同的育種目標，最終導致不同Suwan選系間特性不一，差異明顯。影響玉米農藝性狀的自然因素較多，光照、水分、CO2濃度及土壤肥力等均可對其株型，尤其是穗部產量相關性狀造成明顯影響。本研究采取隨機區組設計，在同等種植條件下對10份貴州常用玉米自交系材料進行農藝性狀考量分析，結果發現地方種質J51的農藝性狀表現較好，符合地方種質在本土自然環境中較高適應力;先鋒選系齊319在農藝性狀評測中表現最差，且同屬溫帶血緣材料的HC和鄭58表現也較差，可能是溫帶血緣材料在貴州地區的適應力較低，不及Suwan種質抗逆耐瘠。

本研究中，每對SSR引物平均檢測到4.17個等位基因，其平均H為0.328，平均PIC為0.656，與胡萍等（2012）、石海春等（2014）、趙寧娟等（2015）、胡德分等（2016）、劉東軍等（2016）、趙文明等（2018）的研究結果相比，所檢測到的平均SSR位點及PIC均偏低，但高于祁志云等（2014）、李世風等（2016）、劉海忠等（2018）的研究結果，可能與本研究涉及的玉米自交系較少且SSR分子標記多態性不高有關?；赟SR分子標記可真實可靠地對玉米種質的遺傳背景及來源進行類群劃分（Yang et al.，2011;Cui et al.，2012;石海春等，2014;劉海忠等，2018）。本研究在SSR分子標記擴增的基礎上，采用NTSYS-2.10e對10份貴州常用玉米自交系材料進行UPGMA聚類分析，結果顯示可劃分為三大類，聚類分析結果與種質來源基本吻合，表明SSR分子標記聚類結果與種質系譜具有較高的一致性。但在本研究中墨黃9號選系雙M9與蘇11和T32聚為一個亞類，而同為Suwan選系的S37單獨聚為一個亞類，其原因可能是：（1）自然界或育種者人為干擾因素導致自交系在選育過程中出現外來基因侵入或自身基因漂移現象;（2）不同育種者對同一自交系進行單株選擇時，其標準不一，最終導致名稱相同，但自交系自身表現出現偏差;（3）自交系被引入后，經多次改良，使其遺傳基礎發生明顯變化。因此，在聚類分析中會出現聚類分析結果與供試材料系譜不完全對應的現象。

4 結論

貴州常用玉米自交系材料具有較廣泛的遺傳基礎，可滿足玉米育種對親本遺傳差異的基本要求。尤其是自交系T32高抗玉米絲黑穗病且在貴州山區具有良好的適應性，為熱帶血緣Suwan選系，明顯區別于改良Reid選系、先鋒選系、美國雜交種選系及貴州地方種質等，可優先用于貴州地區抗絲黑穗病基因發掘、雜交種改良及優良抗性種質資源創建。

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（責任編輯 蘭宗寶）