羅氏沼蝦性別相關基因研究進展及其單性化養殖現狀

姜建萍 袁翔 邱慶慶 黃光華 蔣欽楊 楊秀榮 蔣和生

摘要：羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）具有生長快、養殖周期短、營養價值高等優點，是我國主要的淡水蝦養殖品種，在生長性能方面表現出性別兩態性：同齡雌、雄蝦個體的大小、生長速度相差懸殊，導致大規模生產羅氏沼蝦受到限制，因此迫切需要采用性別控制技術開展羅氏沼蝦單性化育苗，培育全雌/全雄羅氏沼蝦以提高養殖產量，而實現羅氏沼蝦單性化養殖的前提必須明確性別分化和性別決定的分子機制及其關鍵基因。文章就羅氏沼蝦性別相關基因的研究進展及其單性化養殖發展現狀進行綜述，認為全雄/全雌羅氏沼蝦育種的關鍵技術是偽雌或超雌蝦制備。鑒于羅非魚三系[原系（XX♀）、雄性純合系（YY♂）和雄性純合轉化系（YY♀）]配套方案的啟發，今后可對羅氏沼蝦遺傳型WW超雌個體進行性逆轉，獲得偽雄個體（遺傳型WW，生理型ZZ），經回交所得后代用于構建超雌蝦種質庫，即通過性別分化和性別決定機制解析及超雌種質庫構建，研發自主的單性化羅氏沼蝦制種技術，培育全雄/全雌羅氏沼蝦將成為可能。

關鍵詞： 羅氏沼蝦;性別控制;性別相關基因;單性化養殖

中圖分類號： S966.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）09-2111-08

Abstract：Giant freshwater prawn（Macrobrachium rosenbergii） as an important freshwater prawn has become one of the leading varieties of freshwater aquaculture in China due to its quicker growth rate， shorter breeding cycle and higher nutrition. The male and female individuals exhibit sexual dimorphism in terms of growth performance：the size and growth rate of the same age was different， which limited the boost production of M. rosenbergii. Thus， it was urgent to adopt sex manipulation to carry out monosex culture， and to cultivate all-female and all-male prawns to increase the aquaculture yield. The prerequisite of the monosex culture was understanding the molecular mechanism and key genes of sex differentiation and sex determination. Hence， in this paper， the research progress of sex-related genes and research status of monosex culture at home and abroad were summarized， and it was considered that the essential for all-female and all-male breeding was the preparation of neo-female and super female. Inspired by the three-line matching scheme of tilapia[original（XX♀）， male homozygous（YY♂） and male homozygous transformation（YY♀）]， the genetic reversal WW super-female individuals in the future could be sex-reversed， and neo-male individuals（genotype WW， physiologic type ZZ） were obtained. After backcrossing， they were used to construct super female breeding germplasm bank. Notably， it is po-ssible to develop independent parthenogenesis techniques of M. rosenbergii， and to cultivate all-female and all-male prawns through the analysis of the molecular mechanism of sex differentiation and sex determination.

Key words： Macrobrachium rosenbergii; sex control; sex related gene; monosex culture

0 引言

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）屬大型淡水蝦類，具有生長快、養殖周期短、營養價值高等優點，是我國主要的淡水蝦養殖品種。我國于1976年引進羅氏沼蝦，至1990年得到快速推廣。近年來，隨著市場需求的日益增長和人工繁育苗種技術的進步，我國羅氏沼蝦養殖呈現方興未艾之勢。據統計，2016年我國羅氏沼蝦養殖產量達13.2萬t，較2015年增長了2.49%（農業部漁業漁政管理局，2017），其產量已超過全球羅氏沼蝦養殖產量（約23.0萬t）的1/2。與其他甲殼類動物一樣，羅氏沼蝦也表現出性別兩態性：同齡雌、雄蝦個體的大小、生長速度相差懸殊，即在同等養殖條件下，雌蝦生長速度較雄蝦慢50%～70%，性成熟后的雄蝦個體平均體重約是雌蝦的2倍（俞炎琴，2013）。這是由于我國傳統的羅氏沼蝦養殖模式均為雌雄混養，在養殖過程中部分蝦性成熟早，并進行交配繁殖而消耗大量能量，進而影響其生長速度和群體均勻度。為改善這一現狀，部分養殖戶通過人工挑選留大剔小、雌雄分開等方法以提高羅氏沼蝦產量，但此法勞動強度大、成本高，且雌雄幼蝦區分不明顯，導致大規模生產羅氏沼蝦受到限制。因此，迫切需要采用性別控制技術開展羅氏沼蝦單性化育苗，培育全雌/全雄羅氏沼蝦以提高養殖產量，而實現羅氏沼蝦單性化養殖的前提必須明確性別分化和性別決定的分子機制及其關鍵基因。本文就羅氏沼蝦性別相關基因的研究進展及其單性化養殖發展現狀進行綜述，以期為研發羅氏沼蝦性別控制技術提供參考，進而有效指導羅氏沼蝦單性化養殖。

1 羅氏沼蝦性別決定及性別分化

甲殼類動物性別決定類型有遺傳決定型、環境決定型及遺傳與環境共同決定型（樓允東等，2004;周夢穎，2014）。目前，雖然無直接證據證實羅氏沼蝦存在性染色體，但前人的相關研究結果顯示，通過移植促雄性腺（Androgenic gland，AG）獲得的偽雄羅氏沼蝦與正常雌性個體雜交F1代雌雄比例約3∶1，而F1代雌性個體與偽雄羅氏沼蝦回交的F2代中雌雄比例為6.63∶1（Malecha，2012）;此外，通過摘除促雄性腺獲得的偽雌羅氏沼蝦與正常雄性個體雜交，獲得的F1代性別全為雄性（Aflalo et al.，2006;Rungsin et al.，2006）。因此，根據性逆轉及雜交試驗的性別比可推測羅氏沼蝦屬于WZ/ZZ染色體性別決定類型，且表現為雌異（WZ）雄同（ZZ）（Lécher et al.，1995;Benzie et al.，2001;Aflalo et al.，2006;Staelens et al.，2008）。

值得注意的是，甲殼類動物特有的內分泌腺——促雄性腺在雄性甲殼類動物的性別分化、精子發生及雄性第二性征維持中發揮重要作用。尤其對于性別已分化的羅氏沼蝦個體來說，通過人為摘除或植入促雄性腺可使其性別發生逆轉，從而改變生理性別，因此其分泌的促雄性腺激素（Androgenic gland hormone，AGH）不僅是性別決定因素，還是雄性性別分化的調控因子（樓允東等，2004）。此外，甲殼類動物特殊的進化地位導致其性別分化過程極易受外界環境因素如溫度、鹽度、pH、食物豐度、光照和水質，以及環境內分泌干擾物（壬基酚）等的影響（吳楠等，2007;朱春華等，2011;周夢穎，2014;戴習林等，2016）。關于羅氏沼蝦性別分化的時間，朱春華等（2011）通過外部形態觀察結合性腺組織學切片的方法，確定了羅氏沼蝦性別分化和性成熟的時間，具體表現為外部形態特征的出現稍早于內部性征分化時間，且早期分化和性成熟分別發生在幼蝦變態后21和45 d。

2 羅氏沼蝦性別相關候選基因及分子標記

性別控制技術開發是實現羅氏沼蝦單性化養殖的基礎，而性別控制技術的重點在于挖掘和鑒定性別分化與性別決定的關鍵基因。近年來，隨著分子生物技術的快速發展，已有學者通過cDNA文庫構建和轉錄組測序等方法篩選獲得羅氏沼蝦性別相關基因（Cao et al.，2006，2007;Jin et al.，2013;Ma et al.，2019）;同時，借助AFLP（Amplified fragment length polymorphism）技術鑒定出羅氏沼蝦性別特異性分子標記（Ventura et al.，2011;Jiang and Qiu，2013），為實現單性化養殖提供了重要理論依據。

2. 1 性別相關基因

2. 1. 1 Mr-IAG基因 甲殼類雄性動物特異的促雄性腺最先在軟甲亞綱雄蘭蟹中發現，作為特有的內分泌器官，其分泌的促雄性腺激素在促進雄性性別分化過程中發揮重要作用（Sagi et al.，1997）。近年來，促雄性腺特異性基因（Insulin-like androgenic gland，IAG）相繼被發現（Lugo et al.，2006;Manor et al.，2007;Shechter et al.，2008;Rosen et al.，2010）。Ventura等（2009）通過構建羅氏沼蝦促雄性腺cDNA消減文庫鑒定出Mr-IAG基因，經測序比對分析，發現成熟Mr-IAG肽段的半胱氨酸骨架結構與其他甲殼類動物IAG具有高度的同源性;此外，注射Mr-IAG雙鏈RNA會暫時抑制雄性第二性征的重塑和雄性附肢再生，并伴隨蛻皮延后和生長參數下降現象;而沉默Mr-IAG基因表達會引起精子發生阻滯和促雄性腺的肥大增生。鑒于Mr-IAG基因能引起雄性性別分化的逆轉，目前已在小龍蝦（Curtis and Jones，1995;Parnes and Sagi，2002）、青蟹（Trin?o et al.，1999）和斑節對蝦（Gopal et al.，2010）等甲殼類動物中開展了一系列針對IAG基因的性別控制研究。

2. 1. 2 Mr-IR基因 胰島素受體（Insulin receptor，IR）屬于酪氨酸激酶受體超家族，作為胰島素家族信號通路中的重要蛋白，在調節胞內和胞間環境的穩態過程中發揮重要作用（Fafalios et al.，2011）。已有研究表明，胰島素信號通路在性別發育過程中起主導作用（Nef et al.，2003）。Sharabi等（2016）基于多資源信息構建轉錄本文庫鑒定出與脊椎動物IR基因具有較高同源性的Mr-IR基因，并成功克隆獲得該基因的cDNA序列，生物信息學分析結果顯示其編碼1508個氨基酸，包含2個保守跨膜結構域（Transmembrane domain，TM）、2個配體結合結構域、3個纖維蛋白連接素-3結構域及1個酪氨酸激酶結構域。Mr-IR基因在羅氏沼蝦成蝦的各組織中呈廣泛表達模式，但與IR基因在脊椎動物中的表達模式存在差異，如在肌肉組織中不表達（Chen et al.，1996;Steele et al.，1996）。Sharabi等（2016）研究表明，Mr-IR基因沉默并不影響羅氏沼蝦的生長，但顯著影響促雄性腺的增生，促進Mr-IAG基因表達上調和輸精管遠端未成熟精細胞數量大幅增加;配體斑點試驗結果進一步證實，Mr-IR基因與Mr-IAG基因確實存在配體—受體互作現象?？梢?，Mr-IR基因主要通過作用于促雄性腺而調控甲殼類動物性別分化。

2. 1. 3 Mar-Mrr和MRPINK基因 Cao等（2006，2007）以羅氏沼蝦性腺組織為材料，構建雌性和雄性特異的抑制性消減雜交文庫，再通過差異基因表達篩選與測序分析，首次鑒定出與羅氏沼蝦性別相關的基因Mar-Mrr（M. rosenbergii male reproduction-related gene）和MRPINK（Male reproduction-related peptidase inhibitor kazal-type gene）;Northern blotting檢測和半定量RT-PCR結果顯示，Mar-Mrr和MRPNIK基因只在雄性生殖系統中特異表達，且以輸精管中的表達量較高，提示Mar-Mrr和MRPNIK基因可能參與雄性生殖相關的生理過程。Phoungpetchara等（2012）通過RT-PCR和原位雜交技術檢測羅氏沼蝦Mar-Mrr基因的時空表達模式，結果也發現Mar-Mrr基因在雄性生殖系統中特異性高表達，與Cao等（2006，2007）的研究結果一致。關于MRPINK基因，Li等（2008）研究發現，MRPINK蛋白對羅氏沼蝦精子的水解明膠活性具有明顯抑制作用，免疫熒光檢測結果顯示，MRPINK基因特異性結合在精子的基體邊緣部位，通過抑制精子上的類明膠酶而影響精子活性，由此推測其對羅氏沼蝦的受精具有調節作用。

2. 1. 4 MroSxl和MroDmrt基因 Sxl基因是果蠅性別決定的關鍵因子（宋艷等，2009）。俞炎琴（2013）通過簡并PCR和cDNA文庫構建等方法獲得4個羅氏沼蝦Sxl異構體（MroSxl1～MroSxl4）。其中，MroSxl1定位于精原細胞中，推測其參與精細胞生成;Mro-Sxl3和MroSxl4在卵巢中特異性高表達，提示其可能參與卵巢發育。Dmrt（Doublesex and mab-3 related transcription factor）是目前發現對性別決定和性別分化起重要作用的基因家族，其家族成員編碼蛋蟲均包含一個具有DNA結合能力的保守序列——DM結構域（Doublesex和Mab-3）（Zhu et al.，2000;Kopp，2012）。Dmrt基因編碼蛋白作為轉錄調控因子，已被證實與果蠅、水蚤及其他甲殼類動物的性別兩態性和性腺發育密切相關（Burtis et al.，1991;Keyes et al.，1992;Salz and Erickson，2010）。俞炎琴（2013）采用簡并PCR和RACE擴增成功克隆獲得2個羅氏沼蝦Dmart基因（MroDmrt11E和MroDmrt99B），其中，MroDmrt11E基因在精巢中高表達，在卵巢中表達量極低;而MroDmrt99B基因特異性低表達于精巢中;此外，隨著羅氏沼蝦胚胎的發育，MroDmrt11E和MroDmrt99B基因的表達量逐漸增加。

2. 1. 5 其他基因 雌激素相關受體（Estrogen related receptor，ERR）被視為核受體超家族的第三類亞族，參與雌激素受體信號通路。ERR作為真核轉錄因子，在卵巢發育和精子生產過程中發揮重要作用（Beato et al.，1995;Escriva et al.，2000）。趙苗鑫（2016）成功克隆獲得羅氏沼蝦ERR基因的cDNA序列，其組織表達譜顯示ERR基因在雌蝦的卵巢組織中高表達，推測該基因參與調控羅氏沼蝦的卵巢發育（趙苗鑫等，2017）。在前期研究的基礎上，劉金磊等（2018）通過雙鏈RNA（double-strand RNA，dsRNA）干擾沉默羅氏沼蝦ERR基因，并對dsRNA干擾前后的卵巢樣本進行轉錄組測序，結果共獲得318269674條Clean reads和96272條Unigenes，差異表達分析得到2490條上調表達Unigenes、2557條下調表達Unigenes，GO功能富集分析和KEGG通路富集分析發現，差異表達的Unigenes被富集到與生殖相關的GO分類條目或KEGG通路上，且發現ERR基因可能通過影響cyclinB、PPP2A和ADCY9基因表達以調控羅氏沼蝦的卵巢發育。

隨著第二代測序技術的廣泛應用，對羅氏沼蝦性腺進行轉錄組測序已成為挖掘性別決定和性別分化候選基因的主要手段。Jung等（2016）以18尾羅氏沼蝦的卵巢和精巢組織為材料，基于454測序平臺進行轉錄組測序分析，結果得到超過750000條高質量Clean reads和44407條Contigs，在羅氏沼蝦的卵巢和精巢組織分別得到112和270個差異表達基因，提示這些基因可能與性別分化相關。

2. 2 性別相關分子標記

穩定的性別特異分子標記對開展蝦蟹類早期性別鑒定及后期單性化養殖至關重要。Ventura等（2011）利用AFLP技術鑒定出一段與羅氏沼蝦性別相關、3 kb長的基因組區域，且該片段存在串聯序列和逆重復序列。在此基礎上，設計特異性引物并將其轉換為SCAR（Sequence-characterized amplified region）分子標記，進一步分析發現該段序列在雌、雄羅氏沼蝦中存在細微差別：雌蝦中，在SCAR上游區域存在3 bp缺失，且存在2個雌性特異的SNP位點，而該位點基因型表現為雌蝦雜合、雄蝦純合，即SCAR分子標記能有效區分雌、雄和超雌羅氏沼蝦。Jiang和Qiu（2013）利用64對引物組合對羅氏沼蝦進行AFLP擴增，結果獲得8400條條帶，其中13條為雌性特有的條帶，將其進行重擴增、克隆及測序分析，成功篩選出2條可靠的SCAR分子標記。上述研究結果同時進一步佐證羅氏沼蝦可能為WZ/ZZ染色體性別決定類型。

3 羅氏沼蝦單性化養殖

目前，在甲殼類動物中主要采用外源激素處理、溫度調控、種間雜交、雌核發育、多倍體誘導和促雄性腺移植或摘除等方法進行性別控制研究。尤其是性別相關關鍵基因的挖掘與鑒定，為甲殼類動物的性別控制提供了契機，至今羅氏沼蝦單性化養殖已取得長足發展。

3. 1 全雄羅氏沼蝦

國外關于全雄羅氏沼蝦的研究始于1990年。Sagi等（1990）通過摘除早期雄性羅氏沼蝦的促雄性腺，發現其雄性個體性逆轉為雌性個體，即偽雌（表型WZ，生理型ZZ），將偽雌個體與正常雄性個體雜交即可獲得全雄后代。制約該方法推廣應用的最主要技術瓶頸是無法準確、有效地判定羅氏沼蝦的早期發育階段。為克服這一難題，Aflalo等（2006）開發兩步法進行羅氏沼蝦全雄育種，首先摘除雄性親本的促雄性腺并結合后裔測定法確定獲得偽雌個體，然后與正常雄性羅氏沼蝦雜交獲得F1代，經性逆轉后大批量生產偽雌個體，再與正常雄性個體進行回交，而達到大規模生產全雄羅氏沼蝦的目的。隨著羅氏沼蝦性別特異分子標記的成功挖掘，使得其單性化繁殖更便捷，可操作性更強（Ventura et al.，2011）。隨后，Ventura等（2012）采用注射Mr-IAG基因的dsRNA干擾方法（圖1），成功實現雄性羅氏沼蝦的性逆轉并獲得偽雌個體;與正常雄性個體進行雜交后，利用前期鑒定獲得的性別特異分子標記對F1代個體進行驗證，發現F1代羅氏沼蝦全為雄性個體，該結論為后續規?；鄯敝炒蛳铝藞詫嵉幕A。Lezer等（2015）基于性逆轉技術手段進行大規模全雄羅氏沼蝦的生產，并對其后代的生長性狀表型數據進行統計分析，結果發現羅氏沼蝦的性逆轉成功率達86%。通常情況下，偽雌個體的體重較正常雌性個體重，生長速度快，養殖產量較雌雄混養模式提高17%，對應經濟利潤提高60%（呂華當和沙燮雪，2014）。在國內，廣東海洋大學朱春華教授從1994年開始著手于羅氏沼蝦種苗培育技術研究，近年來其團隊基于引進的泰國羅氏沼蝦原種，結合群體選育和物理、化學因素的性別控制等手段，成功培育獲得全雄羅氏沼蝦群體（方瓊玟，2017）。

3. 2 全雌羅氏沼蝦

盡管雄蝦較雌蝦生長快、養殖產出量高;但雄蝦個體大，性情兇殘，且具有明顯的侵略行為和領地意識，導致單位養殖面積養殖密度較低，進而嚴重影響整個羅氏沼蝦群體的生長（Mohanakumaran Nair et al.，2006）。相對而言，雌蝦具有性情溫順、體型較小及單位面積養殖密度高等優點，更重要的是含有高營養價值且味美如蟹黃的生殖腺（Gopal et al.，2010;Malecha，2012）。由于雄性羅氏沼蝦的殘殺現象和雌蝦的高營養價值，相同養殖條件下雌蝦養殖所帶來的經濟效益遠高于雄蝦養殖。早在1992年，國外研究學者就提出甲殼類動物全雌養殖極具優越性的理念（Malecha et al.，1992）。

繼全雄選育之后，全雌養殖模式將成為一個全新的養殖策略。以色列本·古里安大學的Sgai教授團隊率先研發出羅氏沼蝦全雌養殖技術（Levy et al.，2016），該技術是采用移植雄性腺體方法替代傳統的激素、化學處理或轉基因方法，以獲得超雌蝦群體（WW型），目前已實現大規模的商業化模式運轉。羅氏沼蝦全雌養殖的理論基礎是基于促雄性腺對動物性別分化、精子發生及雄性性征的調控作用，其具體操作流程如下：采用眼柄摘除法去除成熟雄性羅氏沼蝦神經內分泌X器官竇腺體復合物，使其促雄性腺肥大增生，然后利用酶解法進行肥大增生促雄性腺（Hypertrophied androgenic gland，hAG）細胞的分離和培養，獲得的hAG細胞培養21 d后，以2×103個細胞為單位注射到羅氏沼蝦幼體第一腹節的肌肉組織中，結合外部形態特征、組織切片觀察及分子標記技術進行偽雄個體鑒定。通過對雌蝦注射hAG細胞后能成功誘導其性逆轉為新的偽雄個體，與正常雄蝦個體雜交后，其子代個體的WW型∶WZ型∶ZZ型比例為1∶2∶1，即獲得25%的WW型超雌個體。采用分子標記技術對WW型和WZ型個體進行分離，再與正常雄性個體進行雜交，可獲得100%的全雌個體（圖2）。大規模養殖結果顯示，全雌養殖模式下羅氏沼蝦具有更優的生長性能，主要表現為：①在成蝦養殖過程中無個體殘殺現象，養殖成活率較混養模式提高22%;②養殖群體中無雄性個體，雌性個體不存在抱卵現象，保證在養殖期間持續增重，成蝦平均體重達40 g/尾左右;③全雌養殖條件下，羅氏沼蝦總產量較混養模式提高36%;④全雌養殖模式顯著提高了成蝦規格均一性，飼料轉化率提高20%。

4 展望

開展性別分化和性別決定相關基因研究是實現羅氏沼蝦單性化養殖及提高其產量的前提工作，但至今鮮見羅氏沼蝦性別相關基因克隆鑒定的研究報道。隨著高通量測序技術的快速發展，利用轉錄組測序技術挖掘缺乏參考基因組信息的羅氏沼蝦性別特異功能基因已成為可能，為揭開羅氏沼蝦性別決定和性別分化的分子機制提供了技術保障?；蚓庉嫾夹g的發展為人類疾病和動、植物復雜性狀的改良提供了機遇，目前已在甲殼類動物基因編輯方面展開了大量研究工作（Hiruta et al.，2014;Nakanishi et al.，2014;Naitou et al.，2015;Martin et al.，2016）。中國科學院海洋研究所張繼泉博士團隊基于CRISPR/Cas9技術成功實現了脊尾白蝦的基因組編輯（Gui et al.，2016;Sun et al.，2017），為羅氏沼蝦性別控制指明了新方向，可基于鑒定獲得的性別決定和性別分化主效基因，借助基因編輯技術實現性別控制?？梢?，全雄/全雌羅氏沼蝦育種的關鍵技術是偽雌或超雌蝦制備。盡管以色列本·古里安大學Sagi教授的團隊（Ventura et al.，2011;Lezer et al.，2015）已將全雄羅氏沼蝦制種技術公之于眾，但具體細節及操作規程仍需進一步摸索完善，加之超雌蝦的制備程序繁瑣，選育耗時較長，且使用年限有限，極大限制了全雌蝦的大規模生產。受羅非魚三系[原系（XX♀）、雄性純合系（YY♂）和雄性純合轉化系（YY♀）]配套方案（楊永銓等，1980，2012）的啟發，今后可對羅氏沼蝦遺傳型WW超雌個體進行性逆轉，獲得偽雄個體（遺傳型WW，生理型ZZ），經回交所得后代用于構建超雌蝦種質庫，即通過性別決定和性別分化機制解析及超雌種質庫構建，研發自主的單性化羅氏沼蝦制種技術，培育全雄/全雌羅氏沼蝦將成為可能。

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（責任編輯 蘭宗寶）