二苯乙烯苷的雌激素樣作用及其對性未成熟小鼠子宮ER表達的影響

朱璨 李堯鋒 彭芳 陳天琪 陸海 劉成 楊長福 王和生

摘 要 目的：探討二苯乙烯苷（TSG）的雌激素樣作用，以及其對性未成熟小鼠子宮雌激素受體（ER）表達的影響。方法：將60只性未成熟雌性昆明種小鼠隨機分為正常組，陽性對照組（戊酸雌二醇，0.18 mg/kg），TSG低、高劑量組（50、150 mg/kg），TSG低、高劑量+戊酸雌二醇組（劑量同單用組）。正常組小鼠灌胃等體積水，各給藥組小鼠灌胃相應藥物溶液0.2 mL/10 g，早晚各1次，連續5 d。末次給藥次日，測定并計算各組小鼠子宮指數和體質量增幅；采用酶聯免疫吸附測定法檢測其血清雌激素[雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）、卵泡雌激素（FSH）]含量；采用蘇木精-伊紅染色法觀察其子宮組織形態學特征，并檢測子宮管徑和子宮內膜厚度；采用免疫組織化學染色法檢測其子宮組織中ER（ER-α、ER-β）的表達水平。結果：正常組小鼠子宮肌層排列平行、緊密，子宮上皮呈單層柱狀，ER-α、ER-β表達較少；各給藥組小鼠子宮管徑、內膜及上皮均不同程度地增大、增厚或增生，ER-α、ER-β表達有所變化。與正常組比較，各給藥組小鼠子宮指數（陽性對照組、TSG高劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組）、體質量增幅（陽性對照組、TSG高劑量組、TSG低劑量+戊酸雌二醇組）、子宮管徑及內膜厚度（陽性對照組、TSG低劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組）、ER-α的表達量（陽性對照組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組）、ER-β的表達量（陽性對照組、TSG高劑量組+戊酸雌二醇聯用組）均顯著升高，血清LH（陽性對照組、TSG高劑量組）、FSH（TSG低劑量+戊酸雌二醇組）水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮指數、子宮管徑及內膜厚度、ER-α及ER-β的表達量以及TSG低劑量+戊酸雌二醇組小鼠體質量增幅、血清E2含量均顯著高于TSG同劑量單用組（P<0.05或P<0.01）；TSG各劑量組小鼠子宮指數、子宮管徑及內膜厚度、ER-α及ER-β的表達量，TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮管徑、ER-β的表達量以及TSG低劑量組小鼠體質量增幅均顯著低于陽性對照組，而TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠血清LH水平均顯著高于陽性對照組（P<0.05或P<0.01）。結論：TSG可一定程度地增加性未成熟小鼠的子宮指數和體質量，并調節其體內雌激素水平，增加子宮管徑及內膜厚度，上調子宮組織中ER的表達，具有一定的雌激素樣作用。但這種作用弱于戊酸雌二醇，且兩者聯合使用可能會拮抗戊酸雌二醇的作用。

關鍵詞 二苯乙烯苷；性未成熟小鼠；雌激素受體；雌激素樣作用；戊酸雌二醇

Estrogen-like Effect of Tetrahydroxy Stilbene Glucoside and Its Effects on the Expression of ER in Uterus of Sexually Immature Mice

ZHU Can1，LI Yaofeng1，PENG Fang1，CHEN Tianqi1，LU Hai2，LIU Cheng2，YANG Changfu1，WANG Hesheng1（1. School of Basic Medicine， Guiyang College of TCM， Guiyang 550025， China； 2. School of Pharmacy， Guiyang College of TCM， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate estrogen-like effect of tetrahydroxy stilbene glucoside （TSG） and its effects on the expression of estrogen receptor （ER） in uterus of sexually immature mice. METHODS： Totally 60 sexually immature Kunming mice were randomly divided into normal group， positive control group （estradiol valerate， 0.18 mg/kg）， TSG low-dose and high-dose groups （50， 150 mg/kg）， TSG low-dose and high-dose groups+estradiol valerate groups （same dose as medication alone group）. Normal group was given constant volume of water intragastrically， and administration groups were given relevant medicine 0.2 mL/10 g， once morning and night， for consecutive 5 d. The uterus index and body weight increase of mice in each group were determined and calculated the next day after the last administration. The contents of serum estrogen （E2， LH， FSH） were determined by ELISA. HE staining was used to observe the morphology characteristics of uterus， and uterine tube diameter and endometrial thickness were detected. The expression of ER（ER-α and ER-β） in uterus was detected by immunohistochemical staining. RESULTS： The myometrium of the mice in normal group was parallel and compact， the epithelium of the uterus was columnar， and the expression of ER-α and ER-β was low. The uterine tube diameter， endometrium and epithelium of mice in each administration group increased， thickened or proliferated in varying degrees， and the expression of ER-α and ER-β changed. Compared with normal group， uterus indexes （positive control group， TSG high-dose group， TSG+estradiol valerate groups）， the increase of body weight （positive control group， TSG high-dose groups， TSG low-dose+estradiol valerate group）， uterine tube diameter and endometrial thickness （positive control group， TSG low-dose group， TSG+estradiol valerate groups）， the expression of ER-α （positive control group， TSG+estradiol valerate groups） and the expression of ER-β （postive control group， TSG high-dose+estradiol valerate group）were increased significantly， while serum contents of LH （positive control group， TSG high-dose group） and FSH （TSG low-dose+estradiol valerate group） were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The uterus index， uterine tube diameter， endometrial thickness and the expression in ER-α and ER-β of TSG+estradiol valerate groups， the increase of body weight and serum content of E2 in TSG low-dose+estradiol valerate group were significantly higher than same TSG dose alone groups （P<0.05 or P<0.01）. The uterus index， uterine tube diameter， endometrial thickness and the expression of ER-α and ER-β in TSG groups， uterine tube diameter and the expression of ER-β in TSG+estradiol valerate groups， body weight increase of mice in TSG low-dose group were significantly lower than positive control group， while serum content of LH in TSG+estradiol valerate groups were significantly higher than positive control group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TSG can increase uterus indexes and body weight of sexually immature mice to certain extent， regulate estrogen level， increase the diameter of uterine tube and endometrial thickness and up-regulate the expression of ER in the uterus， showing certain estrogen-like effect， which is weaker than that of estradiol valerate. Combined use of them may antagonize the effect of estradiol valerate.

KEYWORDS Estradiol valerate； Sexually immature mice； Estrogen receptor； Estrogen-like effect； Estradiol valerate

長期以來，雌激素水平低下引發的更年期綜合征、心血管疾病、骨質疏松等疾病嚴重影響著女性生活質量。雌激素替代療法雖療效顯著，但如高血壓、水腫、癡呆等副作用較多，且會增加雌激素依賴性腫瘤的發生風險[1]。因此，天然的、具有雌激素樣活性且不良反應相對較少的植物雌激素（PE）逐漸成為業界研究的熱點。有研究發現，PE可用于治療圍絕經期綜合征、骨質疏松、心血管疾病、肥胖、代謝綜合征等疾病，療效確切[2]。

制首烏為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）干燥塊根的炮制加工品?，F代研究表明，制首烏具有雌激素樣作用，可改善衰老模型大鼠血清性激素水平，預防和延緩其顆粒細胞凋亡[3-4]。本課題組前期亦發現，制首烏水煎液可調節去卵巢大鼠的生殖軸，亦能抑制雷公藤多苷對大鼠生殖功能的破壞作用[5-6]。制首烏的主要活性成分為二苯乙烯苷（TSG），易溶于水，其含量是制首烏藥材質量控制的專屬性指標[7]。有研究指出，TSG能抗衰老、防治骨質疏松、改善血管性癡呆[8-12]。鑒于此，本研究以剛斷乳且性未成熟的雌性小鼠為對象，通過檢測其經TSG處理后的血清性激素水平、子宮組織形態和雌激素受體（ER，分為ER-α、ER-β亞型）表達情況，評價TSG的雌激素樣作用，以期為制首烏雌激素樣作用的物質基礎研究以及臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

TG20-WS型高速離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）；Varioskan Flash型多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BX53F型生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

TSG對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：J17O8Z45941，純度：≥98%）；戊酸雌二醇片（陽性對照，德國Jenapharm GmbH & Co. KG，注冊證號：國藥準字J20171038，規格：1 mg）；兔ER-α多克隆抗體（美國Abcam公司，批號：GR3203259-1）；兔ER-β多克隆抗體（美國Affinity Biologicals公司，批號：66v5464）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）二抗、二氨基聯苯胺（DAB）辣根過氧化物酶顯色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為01151818022、112117180301）；雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號分別為T1U811PA、A8Z7SYMP、MX6L1XTQ）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級雌性昆明種小鼠60只，出生21 d（剛斷乳、性未成熟），體質量8～11 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供[動物生產許可證號：SCXK（渝）2017-0001]。所有小鼠均分籠飼養，每籠5只，人工控制室溫為（22±2）℃，濕度為42%～62%，晝夜節律12 h。小鼠均自由飲水、進食，適應性飼養4 d。

2 方法

2.1 分組與給藥

將小鼠隨機分為6組，即正常組，陽性對照組，TSG低、高劑量組，TSG低、高劑量+戊酸雌二醇組，每組10只。分組后稱定并記錄小鼠體質量。正常組小鼠灌胃等體積水，各給藥組小鼠均灌胃相應藥物溶液（均以水為溶劑制備）0.2 mL/10 g，早晚各1次，連續5 d。其中，陽性對照組小鼠給予戊酸雌二醇（0.18 mg/kg，根據臨床成人等效劑量換算而得），TSG低、高劑量組小鼠給予TSG（50、150 mg/kg，劑量根據文獻[13]及前期預實驗結果設置），TSG低、高劑量+戊酸雌二醇組小鼠同時給予TSG和戊酸雌二醇（劑量同單用組）。

2.2 小鼠子宮指數和體質量增幅測定

末次給藥次日，采用眼球摘除法取血。血樣室溫靜置2 h后，以1 000×g離心20 min，取上層血清，于-20 ℃保存，備用。斷頸處死小鼠后，迅速剖取子宮，剔除多余組織，稱定子宮質量，計算小鼠子宮指數（子宮指數=子宮濕質量/體質量×100%）。分別于給藥前以及末次給藥次日稱定各組小鼠體質量，并計算體質量增幅[體質量增幅=（給藥后體質量-給藥前體質量）/給藥前體質量×100%]。

2.3 小鼠血清E2、LH、FSH含量檢測

取“2.2”項下血清樣品適量，采用ELISA法以酶標儀于450 nm波長下檢測血清E2、LH、FSH含量，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.4 小鼠子宮組織形態學觀察及子宮管徑、內膜厚度檢測

稱定小鼠子宮質量后，立即用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，下同）清洗，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經乙醇梯度脫水、透明、石蠟包埋后，切片（厚度約5 μm），常規蘇木精-伊紅（HE）染色，封片。每組選取6張切片，置于生物顯微鏡下觀察其子宮組織形態學特征，并采用CellSens Stantard 1.0軟件定量檢測其子宮管徑和內膜厚度。

2.5 小鼠子宮組織ER表達情況檢測

采用免疫組織化學染色法（IHC）檢測。取“2.4”項下石蠟切片，經常規脫蠟、水化后，微波修復，以3%H2O2室溫孵育10 min，用PBS清洗后，滴加相應一抗（1 ∶ 100），于4 ℃孵育過夜；次日用PBS清洗后，滴加相應二抗（1 ∶ 50），室溫孵育30 min，用PBS清洗后，以DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒顯色，用水清洗，以蘇木精復染，脫水、透明、封片后，置于生物顯微鏡下觀察，細胞核被染為棕黃色者為ER-α、ER-β表達陽性。采用Image-Pro Express 5.1圖像處理軟件分析陽性區域的灰度值，用以表示ER-α、ER-β的表達量。

2.6 統計學方法

采用SPSS 17. 0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 TSG對性未成熟小鼠子宮指數和體質量增幅的影響

與正常組比較，陽性對照組、TSG高劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮指數均顯著升高，且TSG各劑量+戊酸雌二醇組均顯著高于TSG同劑量單用組，而TSG各劑量組顯著低于陽性對照組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與正常組比較，陽性對照組、TSG高劑量組、TSG低劑量+戊酸雌二醇組小鼠體質量增幅均顯著升高，且TSG低劑量+戊酸雌二醇組顯著高于TSG低劑量組，而TSG低劑量組顯著低于陽性對照組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 TSG對性未成熟小鼠血清E2、LH、FSH含量的影響

與正常組比較，陽性對照組、TSG高劑量組小鼠LH含量以及TSG低劑量+戊酸雌二醇組小鼠血清FSH含量均顯著降低，而TSG低劑量+戊酸雌二醇組小鼠血清E2水平顯著高于TSG低劑量組，TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠血清LH含量均顯著高于陽性對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而其余各組上述指標組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.3 TSG對性未成熟小鼠子宮管徑、內膜厚度的影響

正常組小鼠子宮肌層排列平行、緊密，子宮腺散在分布于固有層，子宮上皮呈單層柱狀。各給藥組小鼠子宮管徑增大，子宮內膜增厚，腺體數量增多，其中陽性對照組、TSG低劑量+戊酸雌二醇組子宮上皮增生為復層，詳見圖1。

與正常組比較，陽性對照組、TSG低劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮管徑顯著增大、子宮內膜顯著增厚，且TSG各劑量組+戊酸雌二醇組小鼠上述指標均顯著高于TSG同劑量單用組，而TSG各劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮管徑以及TSG各劑量組小鼠子宮內膜厚度均顯著低于陽性對照組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.4 TSG對性未成熟小鼠子宮組織ER表達的影響

由DAB染色結果可見，ER-α、ER-β在小鼠子宮黏膜層、肌層、漿膜層均有表達。正常組小鼠子宮組織ER-α、ER-β的表達均較少。與正常組比較，各給藥組小鼠子宮組織ER-α、ER-β的表達均有所變化，其中陽性對照組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮組織ER-α的表達量以及陽性對照組、TSG高劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮組織ER-β的表達量均顯著提高，且TSG各劑量組+戊酸雌二醇組ER-α、ER-β的表達量均顯著高于TSG同劑量單用組，而TSG各劑量組ER-α表達量以及TSG各劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組ER-β表達量均顯著低于陽性對照組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、圖3、表3。

4 討論

PE與雌激素結構類似，可與體內ER結合并發揮雌激素樣作用；同時，PE也可導致靶組織中ER表達水平發生相應變化[2]。ER包括ER-α和ER-β兩種亞型，前者的總體活性更高[14]。有研究表明，PE對機體具有雙重調節作用：一方面，當體內雌激素水平較低時，PE可與ER結合發揮雌激素樣作用，以防治絕經后雌激素水平過低所引發的健康問題[15-19]；另一方面，當體內雌激素水平較高時，PE可通過競爭性結合靶細胞ER而產生抗雌激素作用，從而抑制雌激素依賴性腫瘤細胞的增殖，并誘導其凋亡[20-23]。

小鼠子宮增重實驗常用來評價藥物的雌激素樣作用[24]。因子宮組織富含ER，當PE與ER結合后，可誘導子宮靶蛋白（IPs）含量增加，從而刺激子宮增重。為盡量減少內源性雌激素對實驗的干擾，本研究選用斷乳、性未成熟的雌性小鼠，測定其給藥后的子宮指數。結果發現，與正常組比較，陽性對照組、TSG高劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮指數均顯著升高，且TSG各劑量+戊酸雌二醇組均顯著高于TSG同劑量單用組，而TSG各劑量組顯著低于陽性對照組；陽性對照組、TSG高劑量組、TSG低劑量+戊酸雌二醇組小鼠體質量增幅均顯著升高，且TSG低劑量+戊酸雌二醇組顯著高于TSG低劑量組，而TSG低劑量組顯著低于陽性對照組。這表明TSG對性未成熟小鼠子宮的生長發育具有一定的促進作用，但這種雌激素樣作用弱于陽性對照藥物及兩者聯用。

在正常的生理狀態下，LH、FSH共同調控機體生殖系統內分泌功能：當血清E2含量升高時，在生殖軸負反饋調節作用下，腺垂體FSH和LH的分泌量將會降低[25]。本研究考察并比較了各組小鼠的血清性激素含量。結果顯示，與正常組比較，陽性對照組、TSG高劑量組小鼠LH含量以及TSG低劑量+戊酸雌二醇組小鼠血清FSH含量均顯著降低，而TSG低劑量+戊酸雌二醇組小鼠血清E2水平顯著低于TSG低劑量組，TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠血清LH含量均顯著高于陽性對照組。這提示TSG具有一定的雌激素樣作用，可一定程度地調節小鼠血清雌激素含量，但這種作用普遍弱于陽性對照藥物。

小鼠子宮組織HE染色結果顯示，正常組小鼠子宮肌層排列平行、緊密，子宮腺散在分布于固有層，子宮上皮為單層柱狀上皮；各給藥組小鼠子宮管徑增大，子宮內膜增厚，腺體數量增多。與正常組比較，陽性對照組、TSG低劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮管徑顯著增大、子宮內膜顯著增厚，且TSG各劑量組+戊酸雌二醇組小鼠上述指標顯著高于TSG同劑量單用組，而TSG各劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇聯用組小鼠子宮管徑以及TSG各劑量組小鼠子宮內膜厚度均顯著低于陽性對照組。經DAB染色可見，ER在小鼠子宮黏膜層、肌層、漿膜層均有表達。與正常組比較，各給藥組小鼠子宮組織ER的表達均有所變化，其中陽性對照組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮組織ER-α的表達量以及陽性對照組、TSG高劑量+戊酸雌二醇組小鼠子宮組織ER-β的表達量均顯著提高，且TSG各劑量+戊酸雌二醇組ER-α表達量顯著高于TSG同劑量單用組，而TSG各劑量組ER-α表達量以及TSG各劑量組、TSG各劑量+戊酸雌二醇組ER-β表達量均顯著低于陽性對照組。兩種染色結果均表明，TSG具有一定的雌激素樣作用，但這種作用弱于陽性對照藥物；當兩者聯合使用時，其作用強度強于TSG單用，但弱于陽性對照藥物，與前文結果基本一致。筆者認為，兩藥聯合可能會導致拮抗效應的出現，即TSG會削弱陽性對照藥物的雌激素樣效應：當體內雌激素水平較高時，TSG競爭性結合ER（包括ER-α、ER-β），而兩者結合后的效應又弱于雌激素與ER結合后的效應，故表現出更弱的雌激素樣作用[26]。

綜上所述，制首烏主要活性成分TSG可一定程度地增加性未成熟小鼠的子宮指數和體質量，并調節其體內雌激素水平，增加子宮管徑及內膜厚度，上調子宮組織中ER的表達，具有一定的雌激素樣作用。但這種作用弱于戊酸雌二醇，且兩者聯合使用可能會拮抗戊酸雌二醇的作用。本課題組將在本研究的基礎上，進一步分析和探討TSG發揮雌激素樣作用的分子機制以及對雌激素依賴性腫瘤細胞的影響，以期為臨床用藥提供更多的實驗依據。

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（收稿日期：2018-07-07 修回日期：2018-12-29）

（編輯：張元媛）