復方紫草油體外抑菌實驗研究

張歷元 李元文 遲慶

摘要 目的：研究復方紫草油主要成分及成藥的體外抑菌作用特點。方法：利用平板打孔法、牛津杯法和菌落計數法研究1）紫草、白芷、忍冬藤水煎液及不同濃度醇提液對金黃色葡萄球菌的抑制能力;2）紫草、白芷的95%乙醇浸泡液及忍冬藤水煎液對創面常見感染菌種和益生菌的抑制作用;3）含50%復方紫草油的復方紫草油-乳化劑混合物對創面常見感染菌種和益生菌的抑制作用。結果：復方紫草油的抑菌特點與紫草醇提物抑菌特點基本一致，對白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等常見感染致病菌的ATCC菌株均有較好抑制作用，同時也對益生菌有一定抑制作用，對大腸埃希菌無效。結論：復方紫草油抑菌譜不等于各組分抑菌譜的簡單疊加。根據該藥抑菌特點，可以考慮用于燒燙傷、特應性皮炎等病的創面護理。

關鍵詞 紫草;金黃色葡萄球菌;表皮葡萄球菌;抑菌特點;細菌培養;平板打孔法;復方紫草油;乳化劑

Abstract Objective：To study the characteristics of antibacterial activity in vitro of the main components and compound medicines of compound Radix Lithospermi oil.Methods：The plate punching method，oxford cup method and colony counting method were used to study 1） the inhibitory ability of Radix Lithospermi，Radix Angelicae Dahuricae，Caulis Lonicerae Decoction and different concentrations of alcohol extract on staphylococcus aureus; 2） inhibition of common infectious strains and probiotics on wounds by 95% ethanol soaking solution of Radix Lithospermi and Radix Angelicae Dahuricae; 3） inhibition of common infectious strains and probiotics on wounds by compound Radix Lithospermi oil-emulsifier mixture containing 50% compound Radix Lithospermi oil.Results：The antibacterial characteristics of compound Radix Lithospermi oil were basically consistent with the antibacterial characteristics of licorice extract，and the ATCC strains of common pathogens such as candida albicans，pseudomonas aeruginosa，staphylococcus aureus，staphylococcus epidermidis had good inhibitory effect，but also had a certain inhibitory effect on probiotics，and was ineffective against Escherichia coli.Conclusion：The antibacterial spectrum of compound Radix Lithospermi oil is not equal to the simple superposition of the antibacterial spectrum of each component.According to the antibacterial characteristics of this medicine，wound care for burns，atopic dermatitis and other diseases can be considered.

Key Words Radix Lithospermi; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Bacteriostatic characteristics; Bacterial culture; Plate punching method; Compound Radix Lithospermi oil; Emulsifier

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.015

紫草屬皮膚科要藥，臨床上紫草油被廣泛用于各類血熱蘊毒型皮膚創面。我國存在多種紫草制劑，其中復方紫草油（國藥準字Z20044385）為目前唯一的國藥準字紫草油之制劑，臨床多用于燒燙傷、尿布皮炎等病。該藥以麻油為基質，主要組成包括紫草、白芷、忍冬藤、冰片。以上組分中，冰片的抑菌作用研究相對完備，體外抑菌實驗證實，冰片對變形桿菌、金黃色葡萄球菌等均具有較好的抑制效果[1]，但冰片在復方紫草油中濃度不超過2.5%，目前尚缺乏對其余三味主要成分的抑菌特點研究。另外，因復方紫草油屬油劑，與抑菌實驗中菌平板的水相基質相斥，用常規直接打孔法無法體現抑菌結果，目前復方紫草油的抑菌特點尚未研明。本研究旨在探索復方紫草油各組分及復方紫草油成藥對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等常見皮膚創面感染致病菌的抑菌作用和特點，為該藥在特應性皮炎、燒傷等創面的護理應用提供實驗室依據。

1 成分單藥對金黃色葡萄球菌抑菌實驗

1.1 材料

1.1.1 微生物 金黃色葡萄球菌ATCC29213菌種純培養物;培養基按照常規方法制作。

1.1.2 藥物 紫草、白芷、忍冬藤飲片制成的100目細粉（健民藥業提供）。

1.1.3 試劑與儀器 乙醇（95%、75%、50%、25%、15% V/V濃度），蒸餾水，生理鹽水，營養瓊脂培養基（北京奧博星生物技術有限公司，批號20170412），瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限公司，批號20180106）。索式回流提取裝置（杭州聚同JTXT-250S）、循環水式多用真空泵（鄭州長城SHB-III）、旋轉蒸發儀（鄭州長城R-1001-VN）、一次性塑料平板（預滅菌），不銹鋼涂布棒，接種環，打孔器，微量移液器（5～10 μL），托盤天平，量筒，游標卡尺等。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備 按流程制備紫草、白芷、忍冬藤不同濃度醇提液及水煎液，具體方法如下：1）乙醇回流提取法：分別取紫草、白芷、忍冬藤粉劑25 g，以8倍量95%乙醇浸泡30 min后，75 ℃加熱回流提取1 h，濾過;在剩余藥粉中加入6倍量95%乙醇繼續回流1 h，濾過。合并兩次回流提取后所得濾液，以旋轉蒸發儀緩慢回收乙醇，剩余液體加入蒸餾水稀釋至8倍量（每毫升含藥量相當于生藥0.125 g），進行封裝。依照上述方法，將乙醇濃度分別置換為75%、50%、25%、15%，并取得相應的藥液。2）乙醇浸泡提取法：分別取紫草、白芷、忍冬藤粉劑25 g，加入8倍量95%乙醇浸泡48 h后，濾過，棄去剩余藥粉，以旋轉蒸發儀緩慢回收乙醇，剩余液體加入蒸餾水稀釋至8倍量（每毫升含藥量相當于生藥0.125 g），進行封裝。3）水煎提取法：分別取紫草、白芷、忍冬藤粉劑25 g，加入8倍量蒸餾水浸泡30 min后，煎煮1 h，靜置降溫沉淀后濾過封裝（每毫升含藥量相當于生藥0.125 g）。完成上述全部流程，即制得21種不同藥液，分別標記并放入4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 平板打孔法抑菌實驗 取妥善保藏的金黃色葡萄球菌菌種，37 ℃無菌條件下培養18～24 h，得指數生長期菌樣本，4 ℃冰箱保存。在小試管中倒入2 mL生理鹽水，將接種環滅菌后，取一定量菌樣本與生理鹽水配成108 cfu/mL菌懸液。調制滅菌培養基并倒入一次性塑料培養皿中，每培養皿10 mL，紫外照射冷卻后，使用微量移液器將100 μL菌懸液加入平板，涂布均勻。用外徑為（5.52±0.31）mm的打孔器（預滅菌）對菌平板進行打孔，每板4孔?？组g距不少于25 mm，孔中心距平皿邊緣不少于15 mm。取一種藥液，在菌平板的3個孔中分別加入50 μL藥液，剩余1孔中加50 μL無菌生理鹽水做為對照。37 ℃恒溫培育24 h。選擇均勻而完全無菌生長的抑菌環，以游標卡尺測量抑菌圈直徑。計算平均值。

1.3 結果 藥液經培養基中的瓊脂擴散自然形成不同濃度梯度，可以憑抑菌環的大小顯示不同藥液的抑菌作用強弱。在相同質量藥物的提取物中，紫草回流提取時使用的乙醇濃度與相應提取物的抑菌效果呈正相關，說明紫草主要抑菌成分在有機相中的溶解度高于水相;而紫草水煎提取物抑菌能力優于15%乙醇回流提取物，提示紫草水煎液中抑菌有效成分或與醇提液中抑菌有效成分不同。不同提取方法所得白芷提取物間抑菌效果差異不顯著，說明白芷抑菌成分在有機相和水相的溶解度接近，對熱的穩定性較好。忍冬藤回流提取時使用的乙醇濃度與其相應提取物抑菌效果呈負相關，使用95%乙醇浸泡法及水煎法所獲提取物抑菌效果均顯著優于95%乙醇加熱回流法提取物，說明抑菌成分在水相中的溶解度高于有機相，長時間受熱易分解。見表1、圖1。

2 成分單藥抑菌特點實驗

2.1 材料

2.1.1 微生物 金黃色葡萄球菌ATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC12228、變形桿菌ATCC6896、乙型副傷寒沙門菌CMCC50094、嗜麥芽窄食單胞菌ATCC17666、腐生葡萄球菌ATCC43867、福氏志賀菌ATCC15922、白色念珠菌ATCC90029、銅綠假單胞菌ATCC27853、鮑曼不動桿菌ATCC19606、大腸埃希菌ATCC35218、肺炎克雷伯菌ATCC13883、產氣腸桿菌CMCC45103、枯草芽孢桿菌ATCC6633。

2.1.2 藥物 紫草、白芷、忍冬藤飲片制成的100目細粉（健民藥業提供）。

2.1.3 試劑與儀器 95%乙醇（V/V濃度），蒸餾水，生理鹽水，營養瓊脂培養基（北京奧博星生物技術有限公司，批號20170412），瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限公司，批號20180106），沙氏保羅培養基（杭州天和微生物試劑有限公司，批號130718）。旋轉蒸發儀（鄭州長城R-1001-VN）、一次性塑料平板（預滅菌），不銹鋼涂布棒，接種環，打孔器，微量移液器（5～10 μL），托盤天平，量筒，游標卡尺等。

2.2 方法

2.2.1 藥液制備 制作紫草、白芷的95%乙醇浸泡液，及忍冬藤水煎液，步驟見1.2.1。

2.2.2 平板打孔法抑菌實驗 依照1.2.2中的操作步驟，分別制作足量的14種菌平板。使用游標卡尺分別檢測紫草、白芷的95%乙醇浸泡液及忍冬藤水煎液作用于14種微生物平板24 h后的抑菌環大小，計算平均值。

2.3 結果 實驗結果顯示，紫草醇提取物能對多數菌種產生良好的抑菌效果;銅綠假單胞菌是燒傷創面感染的主要致病菌[2]，與白色念珠菌一起，多發生于免疫低下人群，是院內感染中主要的病原菌[3]，常通過皮膚破損處侵犯人體，實驗結果顯示紫草醇提取物對二者均有一定特殊抑制作用。變形桿菌和鮑曼不動桿菌都是燒傷創面較易分離得到的菌種[4]，忍冬藤水煎液對二者具有特殊的抑制作用。同時對3種藥液敏感的常見致病菌包括：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌;枯草芽孢桿菌廣泛存在于自然界，具有廣譜抑菌活性，能增強細胞免疫和體液免疫[5]，促進皮損愈合[6]，3種藥液在抑制致病菌的同時亦對該益生菌產生抑制;對3種藥液均不敏感的菌種包括：大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產氣腸桿菌?？蔀榕R床應用提供參考?？傊?，紫草、白芷、忍冬藤的抑菌譜存在一定差異，在抑制致病菌活性同時也抑制益生菌的活動。見表2、圖2。

3 復方紫草油抑菌實驗

前期實驗已知，紫草、白芷、忍冬藤均對肺炎克雷伯菌、產氣腸桿菌、大腸埃希菌無效。復方紫草油成藥中含有冰片，抗菌譜可能發生變化，且忍冬藤抑菌成分在水相溶解度更好。本實驗旨在確認復方紫草油抗菌特點。復方紫草油為油劑，普通的菌平板為瓊脂制作，擴散效果微弱，難以客觀體現抑菌能力，因此需通過加入乳化劑輔助其擴散。

3.1 材料

3.1.1 微生物 金黃色葡萄球菌ATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC12228、變形桿菌ATCC6896、乙型副傷寒沙門菌CMCC50094、嗜麥芽窄食單胞菌ATCC17666、腐生葡萄球菌ATCC43867、福氏志賀菌ATCC15922、白色念珠菌ATCC90029、銅綠假單胞菌ATCC27853、鮑曼不動桿菌ATCC19606、枯草芽孢桿菌ATCC6633。

3.1.2 藥物 紫草油（健民集團葉開泰國藥（隨州）有限公司，國藥準字Z20044385）。

3.1.3 試劑與儀器 失水山梨糖醇單油酸酯（司盤80，東京化成工業株式會社，7ILXB-MN），聚山梨酯80（吐溫80，天津市富宇精細化工有限公司，20161117），單硬脂酸甘油酯（天津市光復精細化工研究所，20170519），營養瓊脂培養基（北京奧博星生物技術有限公司，批號20170412），瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限公司，批號20180106），沙氏保羅培養基（杭州天和微生物試劑有限公司，批號130718），蒸餾水，生理鹽水。干燥箱（上海一恒/DHG-9240A），高壓滅菌器（Tomy SX-500），恒溫培養箱，上海森信/GRP-9160，冷藏冷凍箱（美菱/BCD-301WECK），醫用凈化工作臺（海爾/HCB-1300V），生物安全柜（Eppendorf NU437-60），電子天平（上海舜宇恒平/FA2004），數顯三用恒溫水箱（上海森信/DK-S26），渦旋振蕩器（其林貝爾01-861），一次性塑料平板（預滅菌），消毒棉簽，不銹鋼涂布棒，微量移液器，打孔器，托盤天平，量筒等。

3.2 方法

3.2.1 乳化劑添加比例的確定 將司盤80、單硬脂酸甘油酯和吐溫80按5∶3∶10的比例進行混合[7]，高壓滅菌即得乳化劑。取乳化劑與復方紫草油按20%～80%藥油的不同比例震蕩混勻，濃度梯度為10%，靜置24 h，觀察混合物分層情況?？砂l現復方紫草油濃度在60%以上（含60%）的乳化劑-復方紫草油混合物在靜置后發生分層，故而選擇配制含50%復方紫草油的混合物進行乳化藥品抑菌實驗。

3.2.2 復方紫草油乳化物抑菌實驗 取保存菌種，無菌條件下培養18～24 h，得到指數生長期菌樣本，4攝氏度冰箱保存備用。配置菌懸液108 cfu/mL菌懸液。取1 mL滅菌培養基倒入無菌一次性塑料平板中，輕輕搖晃，使培養基均勻鋪于平板底端，凝固后再放入高溫烘烤滅菌的牛津杯[外徑（5.52±0.32）mm]，每平板放置4個，間距不少于25 mm。再取8.5 mL培養基與500 μL菌液混合，渦旋振蕩器振蕩充分混勻后倒入平板，待凝固后取出牛津杯。將乳化劑與復方紫草油按1∶1（V/V）比例震蕩混勻即得含50%復方紫草油的復方紫草油乳化物，加入菌平板孔中，設置空白乳化劑為對照，放入37 ℃培養箱中培養過夜。

3.3 結果 1）空白乳化劑無抑菌效果。加入該乳化劑不影響實驗結果。2）復方紫草油乳化物（50%濃度）抑菌效果：50%復方紫草油對鮑曼不動桿菌、產氣腸桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌無抑制作用，對于其他菌種則有不同程度的抑菌作用，尤其對銅綠假單胞菌抑制作用較明顯。與各組分藥物抑菌特點比較可知，復方紫草油對銅綠假單胞菌的抑制作用主要來自冰片。見表3、圖3。

4 復方紫草油針對性抑菌實驗（菌落計數法）

皮膚是人體表面直接接觸外界環境的器官，其強大的屏障功能對保持人體健康具有重要意義，包括物理屏障、色素屏障、神經屏障、免疫屏障。其中，物理屏障、免疫屏障均與皮膚微生態的平衡關系密切。皮膚微生態是指人體皮膚表面微生物群構成的復雜生態系統。研究表明，微生態在銀屑病[8]、特應性皮炎[9]等慢性難治性皮膚病的發病中起到重要作用，特應性皮炎與菌群的研究尤為豐富，研究表明，金黃色葡萄球菌在特應性皮炎患者皮損處占絕對優勢，并且金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌的波動與特應性皮炎病情發展密切相關[10]，特應性皮炎患者還往往伴有念珠菌定植[11]。另外，燒傷創面感染主要以銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌為主[12];尿布皮炎與念珠菌感染關系密切[13]。目前復方紫草油常用于燒燙傷、尿布皮炎的護理。通過菌落計數法研究復方紫草油對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌4種重要微生物的抑制作用，可以進一步深化對該藥抑菌作用的認識。

4.1 材料

4.1.1 微生物 革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌ATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC12228;革蘭氏陰性菌：銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC35218。真菌：白色念珠菌ATCC90029。

4.1.2 藥物 紫草油（健民集團葉開泰國藥（隨州）有限公司，國藥準字Z20044385）。

4.1.3 試劑與儀器 失水山梨糖醇單油酸酯（司盤80，東京化成工業株式會社，7ILXB-MN），聚山梨酯80（吐溫80，天津市富宇精細化工有限公司，20161117），單硬脂酸甘油酯（天津市光復精細化工研究所，20170519），營養瓊脂培養基（北京奧博星生物技術有限公司，批號20170412），瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限公司，批號20180106），沙氏保羅培養基（杭州天和微生物試劑有限公司，批號130718），蒸餾水，生理鹽水。高壓滅菌器（Tomy SX-500），恒溫培養箱（上海森信/GRP-9160），冷藏冷凍箱（美菱/BCD-301WECK），醫用凈化工作臺（海爾/HCB-1300V），生物安全柜（Eppendorf NU437-60），電子天平（上海舜宇恒平/FA2004），渦旋振蕩器（其林貝爾01-861），一次性塑料平板（預滅菌），消毒棉簽，不銹鋼涂布棒，微量移液器，托盤天平，量筒等。

4.2 方法 取相應保存菌種，無菌條件下培養18～24 h，得到指數生長期菌樣本，配置106 cfu/mL菌懸液備用。配制含50%復方紫草油的復方紫草油-乳化劑混合物。取2 mL滅菌EP管，加入1 mL混合物和500 μL菌懸液震蕩混勻，設置無菌生理鹽水及空白乳化劑加等量菌液菌為對照，分別孵育0、1、3、6、24 h。取高壓滅菌培養基10 mL，加入孵育后的菌液200 μL，震蕩混勻，倒入無菌培養皿中，待培養基凝固后，放入37 ℃培養箱中培養過夜，再分別進行菌落計數。

4.3 結果 已知復方紫草油對大腸埃希菌無抑菌效果，以其為質控參照。除大腸埃希菌外，復方紫草油乳化物與各菌種充分接觸孵育作用后，其抑菌作用效果在24 h內基本隨著接觸時間的延長而逐漸增長。對白色念珠菌起效時間較晚，但總體抑制效果與其他細菌相近。見表4、圖4～6。

5 討論

組分提取物抑菌實驗表明：1）紫草、白芷、忍冬藤均具備一定抑菌能力;紫草、白芷的抑菌成分在有機溶劑中較易溶出，忍冬藤抑菌成分在水中較易溶出;紫草、忍冬藤的抑菌成分對熱不穩定。2）紫草醇提物能對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌、乙型副傷寒沙門菌、嗜麥芽桿菌、腐生葡萄球菌、福氏志賀菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌等十種致病菌產生良好的抑菌效果。3）忍冬藤水煎液對變形桿菌的抑制作用最為突出。4）紫草、白芷、忍冬藤都可抑制的致病菌包括：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌;都無抑制作用的菌種包括：大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產氣腸桿菌。5）在抑制致病菌的同時，紫草、白芷、忍冬藤對益生菌也有一定抑制作用。

綜合成藥抑菌結果與組分抑菌結果可知：1）復方紫草油可以對多種常見的皮膚感染致病菌產生抑制作用。2）成藥抗菌譜不等于各組分抗菌譜的簡單疊加，復方紫草油抗菌譜主要偏向紫草醇提物抗菌譜。3）復方紫草油在抑制致病菌的同時，對益生菌也有一定抑制作用。4）復方紫草油對白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌均有較好的抑制作用，適用于燒燙傷、尿布皮炎、特應性皮炎等疾病的護理。

尿布皮炎、特應性皮炎等病主要發于幼兒，患者家屬對藥物有效性和安全性都具有較高的期待。中醫外科傳統制劑多具有良好的抑菌作用和免疫調節作用，比較西藥療效溫和，安全性好，但因組方復雜、劑型特殊而長期缺乏針對性的研究。該系列實驗對復方紫草油的體外抑菌特點進行了初步探索，未來將通過更縝密的實驗討論復方紫草油對于皮膚微生態的影響，從而進一步為臨床針對性地運用該藥提供實驗室依據。

參考文獻

[1]陸繼梅，孟建華，安立，等.中醫外科外用散劑組方中藥體外抗菌作用的實驗研究[J].中國藥物經濟學，2012，7（1）：35-38.

[2]陳書楊，高興新，梁自乾，等.小兒燒傷患者病原菌分布及耐藥性分析[J].現代預防醫學，2016，43（6）：1027-1029，1036.

[3]文細毛，任南，吳安華，等.全國醫院感染監控網老年患者醫院感染病原菌及其耐藥特征分析[J].中華醫院感染學雜志，2005，15（12）：1346-1348.

[4]丁華榮，胡加平，李德繪，等.燒傷整形外科1963株細菌及其耐藥情況分析[J].廣西醫科大學學報，2019，36（1）：102-106.

[5]王源，趙文文，刁新平.枯草芽孢桿菌的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2018，4（19）：62-64.

[6]李曉云，牟陽，王淑清.枯草芽孢桿菌活菌制劑促進創傷皮膚愈合的實驗研究[J].黑龍江醫藥，2002，15（5）：369-370.

[7]高媛，劉云云，馬曉昱，等.復方紫草油微生物限度檢查法的建立[J].實用醫藥雜志，2018，35（1）：51-53.

[8]劉小萍，高延瑞.抗菌肽和微生態在銀屑病中的研究進展[J].中國麻風皮膚病雜志，2013，29（11）：712-714.

[9]樊春梅，張虎田.新輔助化療治療晚期卵巢癌的療效觀察[J].中國繼續醫學教育，2016，8（33）：195-197.

[10]Kong HH，Oh J，Deming C，et al.Temporal shifts in the skin microbiome associated with disease flares and treatment in children with atopic dermatitis[J].Genome Res，2012，22（5）：850-859.

[11]張秀欽.特應性皮炎患者皮損致病真菌定植分析[D].福州：福建醫科大學，2013.

[12]楊璐，吳長夢，李慶蓉，等.2073株燒傷患者創面分泌物病原菌種類分布及耐藥性分析[J].中國抗生素雜志，2018，43（5）：577-582.

[13]朱紅，宋莉莉.嬰兒尿布皮炎與念珠菌感染的關系[J].浙江醫學，2002，24（3）：169-170.

（2019-03-31收稿 責任編輯：王明）