胃泌素在結腸癌患者中的表達及其受體拮抗劑對人結腸癌細胞株的抑制作用及其對P38信號轉導通路的影響

王斌峰，鄭麗芳，徐秀華，黃 鋒

王斌峰，鄭麗芳，徐秀華，金華市中心醫院金西院區/金華市婺城區第一人民醫院檢驗科 浙江省金華市 321075

黃鋒，天津市東麗醫院消化科 天津市 300300

核心提要： 胃泌素在結腸癌組織中的表達與腫瘤分化程度有關, 分化程度越高, 其表達量越高, 胃泌素受體拮抗劑在一定濃度范圍內可拮抗胃泌素促增殖效應, 其機制與上調P38、磷酸化-P38、BAX表達及下調Bcl-2表達有關.

0 引言

結腸癌(colon cancer, CC)是我國常見消化系統惡性腫瘤,早期缺乏特異性癥狀診斷率較低, 導致患者喪失根治性機會, 病死率較高, 極大危害患者生命健康. 胃泌素主要是由胃腸道G細胞分泌一種激素, 與胃泌素受體結合后可刺激胃酸分泌, 促進胃腸道黏膜生長. 既往研究證實, 部分結腸腫瘤細胞株能產生胃泌素, 且大腸癌細胞表面表達有胃泌素受體, 因此推測癌細胞能通過自身分泌的胃泌素與對應受體作用, 實現相應生物學效應, 影響著腫瘤細胞增殖, 但其詳細作用及機制尚未明確[1,2].絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一組能被胃泌素等激素激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶, 負責細胞表面與細胞核內部間信號傳遞[3].而P38 MAPK是一種重要細胞內信號轉導分子, 與凋亡的啟動、細胞周期的靜止等息息相關[4]. 本研究選取30例CC患者, 分析胃泌素在CC患者中的表達, 并探討其受體拮抗劑對人結腸癌細胞株的抑制作用及對P38信號轉導通路的影響, 報道如下.

1 材料和方法

1.1 材料 胃泌素受體/膽囊收縮素-B受體(cholecystokinin-B receptor, CCK-BR)mRNA擴增引物(上海生工生物公司)；人大腸癌細胞株SW480(中國科學院上海生命科學研究院)； 熒光染料(Biosharp公司)； 胎牛血清與RPMI-1640培養基(美國Hyclone公司)； 逆轉錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)； 胰蛋白酶(碧云天公司)； Trizol試劑(美國Invitrogen公司)； 5-肽胃泌素(Biosharp公司)； P38與磷酸化P38兔抗人多克隆抗體(美國Cell Signaling technology公司)； 丙谷胺(中國藥品生物檢定所)； β-肌動蛋白抗體(碧云天公司)； 噻唑蘭(MTT, Bio-sharp公司)； ECL化學發光試劑(Millipore公司)； 細胞周期染色試劑盒(凱基公司)； 兔抗人多克隆抗體(Biosharp公司)； 羊抗小鼠多克隆抗體、PVDF膜(上海戶實)； 離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司)； 液氮箱(上海京燦)； 流式細胞儀(美國貝克曼)； 酶標儀(BIOBASE-EL10A, 濟南來寶醫療器械).

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測胃泌素表達： 取2016-01/2018-10我院病理科30例CC患者結腸癌組織標本根據世界衛生組織惡性腫瘤分化程度標準分為低分化標本、中分化標本、高分化標本, 同時選取癌旁腸黏膜組織標本, 切片常規脫蠟、復水, 緩沖液清洗2次, 滴甲醇配制0.3%過氧化氫阻斷液, 10 min后緩沖液清洗, 滴加一抗工作液(稀釋度1：200)37 ℃孵育1-2 h, 緩沖液清洗, 滴加抗體增強劑, 室溫放置20 min, 緩沖液清洗, 滴加二抗, 室溫放置30 min, 緩沖液清洗, 滴加1-2滴DAB Plus Chromogen, 自來水沖洗, 復染, 脫水, 透明, 封片, 觀察不同分化程度患者結腸癌組織中胃泌素表達.

1.2.2 SW480結腸癌細胞株培養： (1)細胞復蘇： 培養基、PBS于37 ℃恒溫水浴預熱備用, 取出SW480細胞冷凍管,立即放入37 ℃水槽中快速解凍, 離心, 棄上清, 加入培養基, 吹打, 移入培養瓶中, 加入適量培養基, 放入CO2培養箱中培養, 瓶壁長滿＞80%時, 進行細胞傳代； (2)細胞傳代： 棄去長滿細胞培養瓶中原培養液, 加入0.5 ml胰蛋白酶, 瓶口塞好橡皮塞, 放在倒置鏡下觀察細胞, 貼壁細胞逐漸趨于圓形, 于未漂起時棄去胰蛋白酶, 加入10 ml培養液終止消化, 用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液, 分裝后繼續培養； (3)細胞凍存： 工作臺與細胞室以紫外線進行15 min照射, 預熱小牛血清、胰蛋白酶、培養液等備用, 收集處于對數生長期細胞(凍存前日最好進行換液),用吸管吸出培養瓶中細胞培養液, PBS洗2遍, 吸出沖洗液, 加入胰蛋白酶消化處理, 棄去消化液, 加入少量新培養液, 吸管吸取培養液對瓶壁上細胞進行拍打, 至細胞懸液后, 加入培養液至凍存管中, 1000 r/min離心10 min, 去上清, 加入凍存液, 吹打成均勻狀態, 放置凍存管至4 ℃10 min、-20 ℃ 30 min、-80 ℃ 16-18 h、液氮槽長期保存.

1.2.3 分組： 將細胞分為對照組(不進行任何藥物處理)、胃泌素組(分別加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 mg/L胃泌素進行處理)、丙谷胺組(分別加入8.00、16.00、32.00、64.00、128.00、256.00 mg/L丙谷胺進行處理)、胃泌素聯合丙谷胺組(加入12.5 mg/L胃泌素與8.00、16.00、32.00、64.00、128.00、256.00 mg/L丙谷胺進行處理).

1.2.4 檢測CCK-BR表達： Trizol試劑提取總RNA, 加入逆轉錄試劑盒合成cDNA, 以cDNA為模板進行PCR反應, 條件為： 共39個循環, 預變性95 ℃ 30 s, 之后每一步變性95 ℃ 15 s, 退火延伸53.9 ℃ 30 s, 制作溶液曲線, 95 ℃變性30 s, 冷卻至65 ℃, 從65 ℃ 10 s開始,每步增加0.5 ℃, 至95 ℃ 10 s, β-肌動蛋白引物序列上下游分別為5′-TGACGTGGACATCGCAAG-3、5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3, CCK-BR引物序列上下游分別為5′-TCTCGCGAGCTCTACTTAGGG-3、5′-AC-CGACGATGCACGTTGAAG-3, 擴增產物為203 bp、185 bp.

1.2.5 檢測結腸癌細胞株SW480活力： 取對數生長期SW480細胞, 加入胰蛋白酶消化處理成單細胞懸液, 應用含胎牛血清10%培養液調整細胞為5×104個/ml濃度,以每孔200 μl接種于96孔培養板, 24 h細胞貼壁后, 去培養液, PBS洗2遍, 加入無血清培養液繼續培養, 24 h后再以每孔200 μl 10%胎牛血清加入. 各組按照預設定方法與濃度進行對應處理, 分別設6個復孔, 培養48 h, 每孔加入10 μl濃度為5 mg/ml MTT, 放入孵育箱孵育(4 h, 37 ℃),去培養液, 各孔加入DMSO 150 μl, 震蕩處理后應用酶標儀檢測光吸收值(OD), 以492 nm下OD表示SW480活力.

1.2.6 細胞增殖檢測： 采用與1.5相同方法調整細胞濃度為1.7×105個/ml, 以每孔2 ml接種于6孔培養板, 培養24 h, 更換無血清培養液繼續培養, 24 h后去上清液, 以每孔2 ml加入含有處理因素1%胎牛血清, 胃泌素組(12.50 mg/L)、丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素聯合丙谷胺組(12.5 mg/L胃泌素與16.00 mg/L丙谷胺)均設復孔5個, 進行48 h培養,消化離心后去上清, 加入1 ml冷PBS震蕩, 離心, 去上清,滴入70% 1 ml冷乙醇進行固定, 過夜(4 ℃), 實施DNA、蛋白質染色, 流式細胞儀檢測細胞增殖情況.

1.2.7 P38信號轉導通路檢測： 細胞總蛋白樣品實施電泳處理后, 轉移至PVDF膜上, 封閉120 min, TBST漂洗2次, 應用5%胎牛血清稀釋至1：2000, 加入一抗, 4 ℃過夜,TBST漂洗3次, 加入二抗(辣根過氧化物酶標記過), 孵育120 min, TBST漂洗3次, 應用ECL顯影, 放于全自動發光圖像系統內成像, 分析平均光密度, 最終結果根據目標基因/β-肌動蛋白確定.

1.2.8 觀察指標： (1)觀察結腸癌組織中胃泌素表達； (2)統計SW480中CCK-BR表達情況； (3)比較各組結腸癌細胞株SW480活力； (4)比較各組細胞增殖指數； (5)比較各組P38信號轉導通路表達情況：P38蛋白、磷酸化-P38蛋白、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、細胞凋亡促進基因(BAX).

統計學處理采用SPSS 22.0統計學軟件處理數據,計量資料以(mean±SD)表示, 多組間比較以單因素方差進行分析, 兩兩比較以LSD-t檢驗.P＜0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 結腸癌組織中胃泌素表達情況 胃泌素陽性反應著色于細胞質, 細胞核未見染色, 分化程度越高, 胃泌素表達陽性率越高, 而在癌旁腸黏膜組織中幾乎不表達(圖1-4).

2.2 CCK-BR表達情況 SW480中CCK-BR PCR擴增產物為185 bp, 表達量為(1.57±0.15).

2.3 結腸癌細胞株SW480活力 胃泌素組、胃泌素聯合丙谷胺組不同濃度范圍內SW480 OD值比較差異具有統計學意義(P＜0.05)； 胃泌素組6.25-200.00 mg/L范圍內SW480 OD值均高于對照組(P＜0.05)； 胃泌素組12.50 mg/L時SW480 OD值最高(P＜0.05)； 胃泌素組25.00-200.00 mg/L范圍內SW480 OD值比較差異無統計學意義(P＞0.05)； 丙谷胺組8.00-256.00 mg/L范圍內SW480 OD值比較差異無統計學意義(P＞0.05)； 胃泌素組聯合丙谷胺組在12.50 mg/L胃泌素聯合16.00 mg/L丙谷胺時, SW480 OD值最低, 低于對照組(P＜0.05), 之后隨著丙谷胺濃度增加, SW480 OD值比較差異無統計學意義(P＞0.05). (表1、圖5).

2.4 細胞增殖情況 各組細胞增殖指數比較差異具有統計學意義(P＜0.05)； 丙谷胺組(16.00 mg/L)細胞增殖指數與對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05)； 胃泌素組(12.50 mg/L)細胞增殖指數高于丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素組聯合丙谷胺組(12.5 mg/L+16.00 mg/L)(P＜0.05). (表2).

2.5 P38信號轉導通路 各組P38蛋白、磷酸化-P38蛋白、Bcl-2蛋白、BAX蛋白表達比較差異具有統計學意義(P＜0.05)； 胃泌素組(12.50 mg/L)P38蛋白、磷酸化-P38蛋白、BAX蛋白低于對照組、丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素組聯合丙谷胺組(12.5 mg/L+16.00 mg/L), Bcl-2蛋白表達高于對照組、丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素組聯合丙谷胺組(12.5 mg/L+16.00 mg/L)(P＜0.05). (表3).

表1 比較各組結腸癌細胞株SW480活力(mean±SD)

表2 比較各組細胞增殖指數(mean±SD，%)

圖2 低分化程度結腸癌組織中胃泌素表達情況.

圖3 中分化程度結腸癌組織中胃泌素表達情況.

圖4 高分化程度結腸癌組織中胃泌素表達情況.

圖5 各組結腸癌細胞株SW480活力.

3 討論

胃泌素廣泛存在于胰腺組織、胃腸道內, 是一種單拷貝基因, 由G細胞轉錄后, 在粗面內質網中翻譯生成前胃泌素原, 并經蛋白酶切割與氨基酸衍生化作用完成翻譯加工, 形成胃泌素[5]. 動物學實驗表明, 胃泌素可通過與自身受體結合促進正常胃腸道黏膜生長[6]. 國外學者研究證實, 胃泌素在CC患者血清中呈高表達狀態[7,8]. 近年來人們發現胃泌素除了這種經典遠距分泌外, 還擁有其他分泌途徑[9-11]. 如Rai等[12]研究指出, 胃癌患者腫瘤組織細胞膜表面存在胃泌素受體, 并推測這可能參與了惡性腫瘤細胞生長的調控. 本研究應用PCR檢測CC癌細胞組織CCK-BR表達, 發現結腸癌細胞株SW480中存在CCK-BR, 提示胃泌素能通過旁分泌途徑發揮生物學效應, 即胃泌素不僅能作用于自身細胞上該因子受體, 參與惡性腫瘤發生, 同時癌細胞產生胃泌素亦能與其表達胃泌素受體結合, 調控惡性腫瘤增殖過程. 同時本研究通過免疫組化染色發現, 分化程度越高, CC組織中胃泌素表達陽性率越高, 提示CC對胃泌素存在依賴性.

體外研究證實, 胃泌素異常表達造成的細胞生長失控可被胃泌素受體拮抗劑抑制[13,14]. 丙谷胺系抗酸藥及治療消化性潰瘍藥物, 具有抗胃泌素作用[15,16]. 本研究結果顯示, 胃泌素組6.25-200.00 mg/L范圍內SW480 OD值均高于對照組(P＜0.05), 提示胃泌素可促進CC細胞株SW480的表達, 抑制細胞凋亡. 且胃泌素組12.50 mg/L時SW480 OD值最高(P＜0.05), 而25.00-200.00 mg/L范圍內SW480 OD值比較差異無統計學意義(P＞0.05), 說明胃泌素12.50 mg/L時促增生能力最強, 繼續增加胃泌素劑量抑制凋亡作用不再持續增強. 分析原因發現, 正常情況下機體胃泌素與其受體處于動態平衡中, 發生病變時這種平衡被打破, 持續高表達胃泌素不斷與受體結合, 使受體減少, 當胃泌素到達一定濃度, 由于受體數量限制,其促進惡性腫瘤細胞增殖作用亦趨于平衡[17-19]. 同時本研究還發現, 丙谷胺組8.00-256.00 mg/L范圍內SW480 OD值比較差異無統計學意義(P＞0.05), 而12.50 mg/L胃泌素聯合16.00 mg/L丙谷胺SW480 OD值最低, 低于對照組(P＜0.05), 之后隨著丙谷胺濃度增加, SW480 OD值比較差異無統計學意義(P＞0.05), 提示丙谷胺在16.00 mg/L時可拮抗胃泌素促增殖效應, 繼續增加濃度, 受其受體飽和影響, 不會增加拮抗效應, 這可為臨床治療CC提供思路與參考.

此外胃泌素組(12.50 mg/L)細胞增殖指數高于丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素組聯合丙谷胺組(12.5 mg/L+16.00 mg/L)(P＜0.05), 直接佐證了胃泌素能促進CC細胞增殖, 但其作用機制目前尚未明確. P38信號通路是MAPK四個亞家族之一, 信號傳導過程精確、復雜, 不同刺激因素可傳遞不同信息, 其中BAX是BCL-2基因家族中細胞凋亡促進基因, 其高表達可拮抗BCL-2促使細胞發生凋亡[20-23]. 鄒存華等[24]報道發現, P38可通過上調uPA表達促進卵巢癌細胞侵襲、轉移. 隋欣等[25]研究指出, P38陽性高表達是胃腺癌預后生存期有利因素. 可見在不同疾病中P38信號通路具有不同生物學效應, 因此有必要探究其在CC中作用. 本研究結果顯示, 胃泌素組P38蛋白、磷酸化-P38蛋白、BAX蛋白低于對照組、丙谷胺組、胃泌素組聯合丙谷胺組, Bcl-2蛋白表達高于對照組、丙谷胺組、胃泌素組聯合丙谷胺組(P＜0.05),提示胃泌素能下調P38、磷酸化-P38、BAX表達及上調Bcl-2表達, 這可能是其促進CC增殖機制. 值得注意的是,目前已明確人結腸癌細胞株有HCT116、HT-29等多種,本研究僅對SW480進行探索, P38信號通路在其他類型是否具有相似影響有待后續基礎實驗及臨床實驗驗證.

白雪皚皚，冬月盈盈，黃粱有夢，萬花有因。這十六字真言并非虛談，說的就是冬至日午夜的星象，合乎王積薪所記媼婦譜，世外的旅客，可據此找到往萬花谷的道路。少年們隨兩位老人往天上看，各自手攀棋盤與樹枝，仰著頭，一時也看得心神俱醉。

表3 比較各組P38信號轉導通路表達情況(mean±SD)

綜上所述, 胃泌素可抑制人結腸癌細胞株SW480的凋亡, 且在結腸癌組織中的表達與腫瘤分化程度有關,分化程度越高, 其表達量越高, 胃泌素受體拮抗劑在一定濃度范圍內可拮抗胃泌素促增殖效應, 其機制與上調P38、磷酸化-P38、BAX表達及下調Bcl-2表達有關.

文章亮點

實驗背景

結腸癌為臨床多見惡性腫瘤, 由于患者前期缺少特異性癥狀, 造成多數患者在就診時已失去最佳手術時機, 對患者身心健康造成了嚴重影響.

實驗動機

胃泌素和其受體能夠刺激分泌胃酸, 加速胃腸道內黏膜的生長, 相關研究顯示, 胃泌素對腫瘤細胞增殖可能有促進作用.

實驗目標

實驗方法

免疫組化檢測臨床結腸癌患者癌組織標本內胃泌素陽性表達, 檢測丙谷胺組對人大腸癌SW480細胞活力、增殖和P38信號轉導通路影響.

實驗結果

結腸癌患者癌組織分化程度越高則胃泌素的陽性率也越高, 丙谷胺可有效抑制SW480細胞增殖.

實驗結論

胃泌素拮抗劑可抑制SW480細胞的增殖, 其作用機制可能和下調Bcl-2表達及上調P38、磷酸化-P38、BAX表達有聯系.

展望前景

今后還需進一步分析其他腸癌細胞如CaCo2、HT29、HCT116等的胃泌素表達水平, 為闡釋胃泌素對結腸癌患者癌細胞的影響提供更有力佐證.