CENPA基因在不同雞種上的序列比較分析

鄭圣晗，陳 穎，陳國宏，常國斌

（揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009）

主要組織相容性復合體（Major histocompatibil-ity complex，MHC）是一組緊密連鎖高度多態的染色體基因群，編碼一組重要的與免疫相關的細胞膜糖蛋白，廣泛存在于有頜脊椎動物中，與宿主的抗病性或免疫應答水平密切相關［1］。1961年Nordskog等［2］將雞的B基因座定義為主要組織相容性復合體，分為2個區域，一個是含有典型MHC基因的BF/BL區域和決定紅細胞抗原的BG區域，另一個是遺傳不連鎖的基因簇Y（Restriction fragment polymorphism-Y，Rfp-Y），Y區與核仁組織區（Nucleolus organizerregion，NOR）連接［3］。在92 kb的BF/BL核心區域共有19個基因，其中包括了CENPA（Centromere protein A，著絲粒蛋白A）基因［4］。

一直以來，疫情是限制養殖業發展的一個重要因素，現在控制疾病的主要手段就是進行疫苗免疫。但是隨著病毒毒力不斷增強，并不能完全保證免疫雞群不會受到感染，因此人們開始轉向抗病育種的研究。著絲粒是與細胞周期、細胞增殖檢查點調控相關的重要結構，參與染色體的移動。組成著絲粒的蛋白種類較多，著絲粒蛋白A是最早被發現的著絲粒家族成員之一，現已成為腫瘤研究的熱點。隨著對CENPA研究的深入，發現CENPA在大多數腫瘤發生、發展過程中起著重要的作用［5-8］。CENPA的乙?；ㄟ^影響CENPA八聚體結構的核小體來影響有絲分裂，但其詳細機制尚不明確。研究還發現，CENPA與自然流產有關［9-10］。本研究利用目標區域捕獲測序技術對CENPA基因進行序列測定，將25個雞種的CENPA基因序列進行比對，統計其SNPs位點和InDel位點，探究不同雞種CENPA等位基因與遺傳抗病力的關系，為家禽的抗病育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取的25個雞種具體情況見表1。

表1 25個雞品種的具體信息Table1 Specific information of 25 chicken breeds

1.2 測序流程

每個雞種選取10個樣本，翅靜脈采血1mL，放入具有肝素鈉的采血管中，然后加入Trizol保存在4℃冰箱中。采取苯酚抽提法提取血液中的DNA，DNA樣品送至深圳華大基因股份有限公司進行目標序列捕獲測序。雞的MHC基因長約98 kb，位于16號染色體上，利用SureSelect Target Enrichment Kit Ion Proton Box 2定制試劑盒并按照Aglient（中國）公司的說明書通過基因組DNA與設計的RNA探針雜交完成目標區域捕獲測序。運用Illumina HiSeq 2000測序，測序的流程為：首先對基因組DNA樣本進行濃度及完整性的檢測；質檢合格后進行文庫的構建，運用超聲破碎技術將基因組打碎，回收長度約為500 bp的DNA片段，對兩端進行修復以及加接頭，橋式PCR完成文庫的構建；庫檢合格后上機測序。針對目標捕獲測序結果的初始數據，首先去除reads中的接頭污染，然后將reads中超過50%的低質量堿基去除［quality value≤5（E）］，確保分析數據的高質量。

1.3 數據分析

在NCBI網站上檢索出Gallus gallus（GG）的CENPA基因序列，以Gallus_gallus-5.0（GCF_000002 315.4）作為參照，利用MEGA 6.06軟件對25個雞種的基因序列進行比對分析，統計SNPs位點及與之對應的氨基酸變化和InDel位點，選用Construct/Test Neighbor-Joining Tree（NJ）方法構建進化樹，Bootstrap的值設置成1 000。

2 結果與分析

2.1 不同雞種CENPA基因的SNPs位點和InDel位點分布

從表2中可以看出，CENPA全長共1 925 bp，位于雞的16號染色體上，處于56 525—58 449的位置，包含了4個外顯子和5個內含子。在25個不同雞種中CENPA共有31個SNPs位點，4種缺失和6種插入。4個外顯子上只有4個SNPs，沒有插入缺失。5個內含子中只有3個內含子有SNP和InDel，共有27種SNPs，4種插入和6種缺失。由表3可以看出，在4個外顯子上，25個雞種累計只有8個SNPs。只有7個雞種在外顯子上有SNPs位點，其他雞種上沒有出現。Exon1和Exon4上的突變都屬于同義突變，并沒有引起氨基酸的改變。Exon2上的突變屬于錯義突變，突變為C57066T，該突變導致編碼蛋白P變成了蛋白L。由此表明CENPA的外顯子沒有豐富的多態性，CENPA內含子的豐富多態性體主要現在Intron4上。在Exon3上所有的雞種都沒有SNPs位點和InDel位點，表明CENPA基因在Exon3具有保守性，在雞的進化歷史中穩定遺傳。

表2 不同雞種CENPA基因的外顯子和內含子變化統計Table 2 The changes of exon and intron in CENPA gene of different chicken breeds

表3 不同雞種CENPA基因上SNPs及對應氨基酸變化Table 3 The changes of SNPs and corresponding am ino acid in CENPA gene of different chicken breeds

2.2 CENPA基因的MEGA系統進化樹分析

圖1所示，25個雞種大致可被分為4大類，太湖雞（TH）、廣西三黃雞（GXH）、河南斗雞（DJ）和白耳黃雞（BE）聚為一類；羅斯雞（RS）、溧陽雞（LIY）、隱性白羽肉雞（YXB）和藏雞（ZJ）等聚為一類；雪山草雞（XUS）、如皋黃雞（RGH）、北京油雞（BJY）和文昌雞（WC）等聚為一類，狼山雞（LS）、茶花雞（CH）、安卡紅雞（AK）和仙居雞（XJ）等聚為一類。說明中國地方雞品種間的同源性較小，CENPA基因隨著雞的進化也逐漸多元進化，不同雞種上CENPA基因具有豐富的遺傳多樣性。

圖1 不同雞種CENPA基因的NJ進化樹Fig.1 The NJ tree of CENPA gene in different chicken breeds

3 討論

遺傳多樣性一般是指種內不同群體之間或一個群體內不同個體之間遺傳變異的總和，對家禽遺傳多樣性的研究有助于分析家禽的起源進化并為抗病育種提供理論依據。研究結果顯示，CENPA在Exon2上有錯義突變，且只發生在3個雞種中，表明Exon2在CENPA基因中起到比較關鍵的作用。而Exon3在25個雞種中完全保守，在進化中穩定遺傳，可作為CENPA的標記外顯子。Exon1和Exon4雖然有SNP，但屬于同義突變，故Exon1和Exon4也是保守區域。CENPA不具有豐富的多態性，4個外顯子中有3個是保守區域，推測CENPA編碼的是雞的基礎抗病基因。雪山草雞是利用中國優質地方良種藏雞、茶花雞經雜交選育而成的草雞新品種。茶花雞是由野生紅色原雞經長期馴化選育而成的，是中國不可多得的原始雞種。雪山草雞具有紅色原雞的血統，但是兩者并不聚在一類。雪山草雞和紅色原雞在Exon2上有相同的SNPs位點，兩者都具有較高的抗病性，表明該SNP位點與雞的優良抗病性有一定關系。

本研究選擇的是普遍使用的NJ樹，通過Bootstrap處理使其能夠很直觀地看出不同雞種間的起源關系。有研究發現，中國地方雞種的雜合度值要明顯高于其他蛋雞、肉雞等商業品系及歐洲地區的部分地方品種，同時有研究發現我國許多地方家禽品種擁有較強的抗病能力和免疫能力［11-15］。羅斯雞、隱性白羽肉雞、來航雞和安卡紅雞屬于國外雞品種，為觀察國外雞種與國內雞種的差別，對國外雞種的聚類情況進行了分析。結果發現，羅斯雞和隱性白羽肉雞聚為一類，來航雞和安卡紅雞各聚在一大類。羅斯雞和隱性白羽肉雞屬于快大型白羽肉雞，安卡紅雞屬于速生型黃羽肉雞，它們的生長速度都很快，但和我國地方黃雞相比，適應性和抗病性都更低。在4個國外雞品種中只有羅斯雞在Exon4上的出現同義突變，大部分雞種在Exon4上沒有SNP和InDel，表明CENPA的Exon4上的SNPs位點無法確定與抗病性是否有關。我國地方雞種普遍具有較強的適應性和抗病性，且分布區域廣泛，狼山雞、鹿苑雞、溧陽雞、太湖雞和如皋黃雞都是江蘇省內的地方雞種，這5個雞種被分為了4個大類，表明這5個雞種之間的同源性較低。其他區域的雞種也是分類廣泛，表明我國的地方雞品種資源豐富，且之間的同源性較低，大部分雞種擁有較強的抗病性，可為抗病育種的研究提供豐富的樣本。本研究篩選出的CENPA的內含子具有豐富的多態性，而外顯子上的SNPs位點是否與抗病有關，CENPA基因具體怎么對抗病性產生影響，還有待進一步研究。