微波和超聲波輔助萃取廢棄煙葉及煙桿中煙堿的研究

王 瑩 ，楊海朝 ，劉鳳霞 ， 薛 剛 ，黃亞平

（1.南陽理工學院，河南南陽 473004；2.河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南南陽 473004；3.河南順天生物科技有限公司，河南南陽 473300）

煙堿是生產綠色食品理想的高效殺蟲劑和生物性農藥[1-2]，用途十分廣泛。在卷煙工業中用天然煙堿配制的香精具有顯著增加香氣和勁頭的作用，在葉組配方中減少了對上等煙葉的用量，降低了卷煙成本[3]。隨著煙草工業、精細化工、制藥、有機合成、國防、農藥等的迅速發展，市場對煙堿的需求與日俱增。煙堿的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法、離子交換樹脂法、超臨界流體萃取法、液膜分離法等[4-7]。水蒸氣蒸餾法是提取天然煙堿較為原始的工藝，利用煙堿在堿性條件下能與水蒸氣共同揮發而不分解的特性[5]進行提取，該方法流程簡單、操作方便，但是會耗費大量的能源、效率低。國內外也有報道用超臨界二氧化碳萃取技術從煙草中提取煙堿，該方法雖然提取率較高，但設備投資和維修費用大、設計和制造技術要求高、生產能力低。溶劑萃取法是將煙葉浸泡后用石灰乳處理凈化，用Na2CO3去除殘存的Ca2+離子，澄清液用氯代烯烴、乙醚、氯仿、溶劑油等有機溶劑萃取，萃取液用硫酸洗脫，煙堿從有機相轉移到水相成硫酸煙堿，萃取液用硫酸洗脫，煙堿從有機相轉移到水相成硫酸煙堿，多次富集得硫酸煙堿產品。但該方法操作步驟復雜、萃取時間較長，而且會產生大量廢水，為廢水處理帶來困難。

對于生產煙堿粗品來說，最簡單的就是酸性水提法，但傳統浸提法存在提取時間長的缺點，如果加以微波和超聲波輔助，可大大縮短提取時間。謝長芹和陳麗金等人[6-7]以廢次煙葉為原料研究了微波法提取煙葉和煙末中煙堿的技術，周民杰和朱松等人[8-9]利用超聲波提取低次煙葉中煙堿。試驗同時研究優化微波和超聲波輔助提取煙廢棄煙葉及煙桿中煙堿的工藝，為企業萃取煙堿提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

材料：河南省種植的廢棄煙葉和煙桿，河南順天生物科技有限公司提供。

試劑：氫氧化鈉、氯化鈉、硅鎢酸 鹽酸、98%濃硫酸等，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供。

儀器：BILON-2008型低溫超聲波萃取儀，上海比朗儀器有限公司產品；XH-MC-1型微波輔助反應儀，北京祥鵠科技發展有限公司產品；752N型紫外可見分光光度計，上海精科實業有限公司產品；TGL-16C型高速離心機，上海安亭科學儀器廠產品；BSA224S-CW型電子天平，Sartorius中國有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 廢棄煙葉及煙桿中煙堿含量及提取率的測定

（1）原料中煙堿含量測定。蒸餾時稱取1 g粉碎后的煙葉或煙桿于500 mL蒸餾瓶中，加入20 g NaCl和2 g NaOH，用30 mL水將煙桿沖下，立即將蒸餾瓶連接于水蒸氣蒸餾裝置進行蒸餾。用內含10 mL 1 mol/L H2SO4溶液的250 mL三角瓶作為接收器，冷凝管末端應浸入H2SO4溶液中。蒸餾過程中蒸餾瓶內的液體體積應保持恒定，必要時可適當加熱。收集220～230 mL餾出液，用小試管取餾出液1 mL，加1滴濃度為2.4 mol/L的HCl溶液和1滴濃度為0.036 mol/L硅鎢酸溶液，不顯渾濁時可停止蒸餾。取下容量瓶，同時用水沖洗冷凝管末端，確認容量瓶處于室溫。用水定容至刻度，搖勻。若餾出液不澄清，則將其過濾。

紫外分光光度法餾出液中總植物堿的含量：用移液管吸取10 mL的餾出液于50 mL容量瓶中，用濃度為0.025 mol/L的H2SO4溶液定容至刻度，以濃度為0.025 mol/L的H2SO4溶液作參比，用紫外分光光度計測定溶液在波長236，259，282 nm處的吸光度。若259 nm處的吸光度超過0.7，應取較小體積的餾出液重新稀釋測定。

煙堿含量的結果計算如下：

式中：F——稀釋倍數；

m——試樣質量，g；

N——總質量百分含量，%；

W——試樣的水分含量，%。

2次平行測定精確至0.01%，測定結果之差不大于0.05%。

（2）煙堿提取率計算。干廢棄煙葉或煙桿經曬干、粉碎后，水浴浸提、過濾得濾液，濾液經濃縮即得煙堿粗品，稱量，濃縮物再經濃度為1 mol/L的硫酸溶液吸收后，取出10 mL濃縮液用濃度為0.025 mol/L的硫酸定容至50 mL，紫外分光光度計測定其純度。計算公式如下：

式中：M——浸提液中濃縮物質量，g；

X——濃縮物中煙堿含量，g；

M0——原料質量，g；

X0——原料中煙堿含量，g。

1.2.2 煙堿提取的單因素試驗設計

（1）pH值對煙堿提取率的影響。稱取5份5.0 g粉碎的廢棄煙葉或煙桿，分別置于5個250 mL的錐形瓶中，在料液比1∶15，浸提溫度70℃，浸提時間2 h，浸提次數1次的條件下，向5個錐形瓶中各加入75 mL pH值分別為2，3，4，5，6的水溶液，在水浴振蕩搖床上振蕩萃取，得到的萃取液經濃縮稀釋后，采用紫外分光光度法測定煙堿的吸光度，并利用公式（2）得出煙堿的提取率。

（2） 萃取時間對煙堿提取率的影響。稱取5份5.0 g粉碎的廢棄煙葉或煙桿，分別置于5個250 mL的錐形瓶中，再加入75 mL pH值為2的水溶液，在浸提溫度70℃，浸提次數1次的條件下，設定水浴萃取時間分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h，在水浴振蕩搖床上振蕩萃取，得到的萃取液經濃縮稀釋后，采用紫外分光光度法測定煙堿的吸光度，并利用公式（2） 得出煙堿的提取率。

（3） 萃取次數對煙堿提取率的影響。稱取4份3.0 g粉碎的廢棄煙葉或煙桿，分別置于4個250 mL的錐形瓶中，每次加入45 mL pH值為2的水溶液，70℃下在水浴振蕩搖床上振蕩萃取2 h，分別萃取1，2，3，4次，將每次萃取得到的萃取液合并經濃縮稀釋后，采用紫外分光光度法測定煙堿的吸光度，并利用公式（2）得出煙堿的提取率。

（4） 料液比對煙堿提取率的影響。稱取5份3.0 g粉碎的廢棄煙葉或煙桿于5個250 mL的錐形瓶中，分別按 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30的料液比加入pH值為2的水進行浸提，浸提溫度70℃，浸提時間2 h，浸提次數1次，得到的萃取液經濃縮稀釋后，采用紫外分光光度法測定煙堿的吸光度，并利用公式（2）得出煙堿的提取率。

1.2.3 微波和超聲波輔助萃取煙堿的正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，利用微波或超聲波輔助萃取做三因素三水平的優化試驗，從單因素試驗中選出適當反應條件，對其進行優化試驗，選取pH值、反應時間、料液比3個因素，采用L9（34）正交表進行優化試驗。其中，選定微波輔助功率400 W，輻射溫度65℃。

2 結果與分析

2.1 廢棄煙葉和煙桿中煙堿含量的測定

根據水蒸氣蒸餾法測定干煙葉中煙堿的含量，用紫外分光光度計測定餾出液中煙堿含量。

單因素試驗結果見表1，單因素試驗的方差分析見表2。

結果表明，河南豫煙的廢棄煙葉和煙桿中煙堿含量的平均值分別為1.583%和0.387%。

2.2 pH值對煙堿提取率的影響

表1 單因素試驗結果

表2 單因素試驗的方差分析

分別選取不同pH值條件下的水溶液對廢棄煙葉和煙桿進行浸提，置于70℃的水浴搖床上，浸提2 h后抽濾，濾液濃縮，測濃縮物的質量及其煙堿含量，利用公式（2） 計算煙堿的提取率，結果見表1。以提取率為指標進行單因素方差分析，結果見表2。經方差分析可知，不同pH值之間差異達到顯著或極顯著水平（廢棄煙葉F=10.696**，煙桿F=4.8*）。pH值5和pH值4條件下廢棄煙葉及煙桿的提取率較高，它們之間差異不顯著（顯著性檢驗略）。

2.3 萃取時間對煙堿提取率的影響

用pH值4的水溶液對廢棄煙葉和煙桿進行浸提，分別選取不同的萃取時間，置于70℃的水浴搖床上，浸提后抽濾，濾液濃縮，測濃縮物的質量及其煙堿含量，利用公式（2）計算煙堿的提取率（表1），當萃取時間為1 h和2 h時提取率較高。以提取率為指標進行單因素方差分析（見表2）。由表2可知，不同提取時間下對廢棄煙葉煙堿提取率達到極顯著水平（F=13.465**），對煙桿煙堿提取率不顯著。

2.4 萃取次數對煙堿提取率的影響

用pH值4的水溶液對廢棄煙葉和煙桿進行浸提，分別選取不同的萃取次數，每次萃取1 h，置于70℃的水浴搖床上，浸提后抽濾，濾液濃縮，測濃縮物的質量及其煙堿含量，利用公式（2）計算煙堿的提取率（見表1）。以提取率為指標進行單因素方差分析（見表2）。

結果說明，萃取次數2～3次提取率高；方差分析結果顯示，萃取次數差異達到極顯著水平（廢棄煙葉F=36.684**，煙桿F=13.222**），最好次數為2～3次。

2.5 料液比對煙堿提取率的影響

用pH值4的水溶液對廢棄煙葉和煙桿進行浸提，分別選取不同的料液比，萃取1次，萃取時間為1 h，置于70℃的水浴搖床上，浸提后抽濾，濾液濃縮，測濃縮物的質量及其煙堿含量，利用公式（2） 計算煙堿的提取率（見表1）。以提取率為指標做單因素方差分析（見表2）。

由表1可知，料液比1∶25時提取率高。方差分析說明料液比差異達到極顯著水平（廢棄煙葉F=136.079**，煙桿F=46.114**），最佳料液比1∶25。

2.6 正交試驗

選取pH值、料液比、微波時間或超聲波時間3個因素設計正交試驗，利用微波或超聲波輔助萃取煙堿。

正交試驗因素與水平設計見表3。采用公式（2）測定各組試驗所得煙堿提取率。超聲波和微波輔助萃取煙堿的正交試驗結果見表4。

超聲波和微波輔助萃取的正交試驗結果（見表4）說明，從表觀上看微波輔助萃取提取率高于超聲波輔助萃取。極差分析結果是超聲波輔助萃取廢棄煙葉的最優組合為A1B3C3，即pH值4，超聲時間180 s，料液比1∶25；超聲波輔助萃取煙桿的最優組合為A2B3C3，即pH值5，超聲時間180 s，料液比1∶25；微波輔助萃取廢棄煙葉的最優組合為A2B2C3，即pH值5，微波時間20 s，料液比1∶25；微波輔助萃取煙桿的最優組合為A2B3C3，即pH值5，微波時間30 s，料液比1∶25。從最優順序看均為B＞A＞C，說明超聲波和微波輔助效果最好。

表3 正交試驗因素與水平設計

表4 超聲波和微波輔助萃取煙堿的正交試驗結果

續表4

表5 正交試驗的方差分析

正交試驗的方差分析見表5。

由表5可知，超聲波和微波輔助萃取的B因素達到顯著水平，因此B因素應該控制在最優B3水平。盡管A因素不顯著，結合極差分析說明，A因素應為A2水平。C因素可以在選任何一個水平，為節省濃縮時間和濃縮能耗C因素應在C1水平。最后確定最佳組合為A2B3C1，即pH值5，料液比1∶15，超聲時間180 s或微波時間20～30 s。

3 結論

（1）單因素試驗表明，河南豫煙廢棄煙葉和煙桿中煙堿含量的平均值分別為1.583%和0.387%，低于云南和貴州。如要變廢為寶，應綜合考慮煙油、煙浸膏等的提取。研究確定pH值5和pH值4條件下廢棄煙葉及煙桿的提取率較高。試驗沒有設定堿性條件是因為在堿性條件下，煙堿為游離煙堿。當萃取時間為1 h和2 h時提取率較高，萃取次數2～3次提取率高，最佳料液比1∶25。

（2） 超聲波和微波輔助萃取的正交試驗結果表明，超聲波和微波輔助萃取的效果達顯著，通過極差分析和方差分析確定最佳組合均為A2B3C1，即pH值5，料液比1∶15，超聲時間180 s或微波時間20～30 s。