青翹中抑制乙酰膽堿酯酶活性成分篩選

董哲,閆曉娟,杜會枝

(山西大學 分子科學研究所,山西 太原 030006)

0 引 言

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種以學習、認知和記憶障礙等為特征的神經退行性疾病。AD的膽堿能缺失學說認為:乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)的合成、釋放及攝取減少或降解過多,造成ACh水平降低,進而導致AD病人學習能力下降和記憶力衰退[1]。乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是中樞神經系統中水解ACh的一個主要功能酶,解剖學研究發現,AD患者腦部的AChE蛋白表達水平升高[2-3]。近年來乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究越來越多[4],目前美國食品藥品管理局(FDA)批準上市的治療AD的藥物主要是AChE抑制劑,包括多奈哌齊、利凡斯的明和他克林等[5],但它們也有很明顯的副作用和毒性,且生物利用率低。因此,尋找新型、效率高且低毒的AChE抑制劑是研究熱點之一。

天然中草藥多種多樣,資源豐富,治療疾病時表現出毒副作用小,所以,得到越來越多研究人員的關注[6-7]。連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl),木犀科連翹屬植物,其果實是一種傳統中草藥,也是山西道地中藥材之一[8]。據藥典記載,連翹有清熱解毒和消腫散結等功效[9]?，F代藥理學研究表明,連翹具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理功效[10]。夏秋交際之時,果實剛熟還帶有綠色時采摘,除去雜質,將其蒸熟,晾干得到的果實即為青翹(GreenForsythiasuspensa)。目前已經從動物實驗研究發現連翹主要成分之一——連翹酯苷A對AD動物模型的學習記憶有改善作用[11-16],但尚未闡明連翹及其主要成分是否可以影響膽堿能系統發揮神經保護效應。本文采用Ellman法[17-18]對青翹中的AChE抑酶活性成分進行了篩選,并用敲除法進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑藥品

青翹,2016年7月份采摘于山西省長治市屯留縣,經山西大學張立偉教授鑒定為木犀科連翹屬連翹果實,樣本編號為 20160702,自然陰干,用粉碎機磨成細粉,過60目篩,室溫下密封避光保存。

AChE(E.C. 3.1.1.7,來源于電鰻魚,編號:A832424,200 U/g)購于麥克林;碘化硫代乙酰膽堿(S-Acetylthiocholine iodide,Asch,編號:A602737)和5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB,編號:A620113)購于生工(上海);連翹酯苷A(編號:A0590)、蘆丁(編號:A0103H)、連翹脂素(編號:A1144)和連翹苷(編號:A0272)購于成都曼思特(純度均大于98%);色譜醋酸(編號:A35-500)和色譜甲醇(編號:A456-212)購于Fisher Scientific(上海);無水甲醇(編號:2334)購于天津市大茂化學試劑廠;D101大孔樹脂購于天津制膠廠。其他試劑藥品均為國產分析純。

1.2 青翹的提取與分離

青翹粉末200 g,70%甲醇(V/V)為溶劑,以料液比1∶10,回流提取2次,每次2 h。用紗布粗濾,合并2次濾液。真空抽濾,濾液用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮,得到青翹粗提物。

1.3 不同乙醇濃度洗脫物制備

將青翹粗提物按照水,20%、40%、60%、80%和95%乙醇(V/V)的順序過D101大孔樹脂,梯度洗脫,將不同梯度洗脫物分別合并濃縮,冷凍干燥,得固體粉末,依次標記為Q1、Q2、Q3、Q4、Q5和Q6。

1.4 AChE酶活測定

不同乙醇濃度洗脫物溶于DMSO中,配制樣品液。

在96孔板中利用Ellman方法[14-15]測定AChE酶活。一個EP管中依次加入275 μL PBS(pH=8.0),5 μL酶液(終濃度0.07 U/mL),10 μL樣品溶液和10 μL的DTNB(終濃度1 mmol/L),混合均勻。96孔板中每孔加入100 μL混合溶液,37 ℃ 孵育15 min后,加10 μL Asch(終濃度3 mmol/L),37 ℃ 繼續孵育25 min后,加入50 μL 4% SDS終止反應。用MD Spectra Max 190酶標儀(美國)在412 nm下測吸光度值A。平行3次實驗,每次3個復孔。反應體系中以不加酶作為空白組2,不加抑制劑作為空白組1。根據公式(1)計算酶活抑制率:

.

(1)

1.5 連翹酯苷A敲除實驗

Q2凍干粉末溶于DMSO中配制成80 mg/mL溶液,在Shimadzu LC-6AD液相儀(日本)進行連翹酯苷A敲除實驗。進樣量為400 μL。分析條件:Microsorb 100-5 C18 (21.4 mm×250 mm) 色譜柱,流速為0.8 mL/min,檢測波長為280 nm,以色譜甲醇為流動相A,以質量分數0.3%醋酸水溶液為流動相B;梯度洗脫條件為:0～8 min,30%～33%(A),70%～67%(B);8～24 min,33%～40%(A),67%～60%(B);24～39 min,40%～48%(A),60%～52%(B);39～55 min,48%～64%(A),52%～36%(B)。22～26 min接出的樣品即為敲除的連翹酯苷A。合并22 min之前和26 min之后的樣品,即為敲除連翹酯苷A之后的剩余部分,我們定義為剩余物。將敲除的連翹酯苷A和剩余物部分分別冷凍干燥。

1.6 液相分析

將梯度洗脫物和剩余物樣品分別用色譜甲醇配制成1 mg/mL溶液,用Agilent 1260高效液相色譜儀(德國)進行液相分析。進樣量為10 μL。分析條件除色譜柱為Agela Technologies Venusil XBP-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)外,其他條件與‘1.5連翹酯苷A敲除實驗’相同。

2 結果與討論

2.1 不同乙醇濃度洗脫物對AChE酶活的抑制作用

不同乙醇濃度洗脫物對AChE酶活的抑制情況如表1所示,隨洗脫物濃度的增大(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg/mL),Q2、Q3和Q4對AChE的抑制作用均逐漸增強,其中Q2對AChE的抑制作用(IC50值為(0.44 ± 0.002)mg/mL)強于Q3和Q4對AChE的抑制作用,IC50值分別為(0.68 ± 0.002)和(1.12 ± 0.002) mg/mL;而Q1,Q5和Q6對AChE沒有抑制作用,數據未顯示。

表1 Q2,Q3和Q4對AChE的抑制作用(%),數據表示為means ± SEM (n=5)

由液相圖(圖1)可以看出,Q2主要成分為:連翹酯苷I、連翹酯苷B、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A和蘆丁。Q3主要包括:連翹酯苷I、連翹酯苷B、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷。Q4主要成分為:連翹酯苷I、連翹酯苷B、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A和連翹苷。根據圖1得到的主要成分含量如表2所示:連翹酯苷A峰面積占比在Q2中是68.91%,Q3中為67.39%,Q4中是16.46%;而Q1,Q5和Q6中幾乎沒有連翹酯苷A。Q2和Q3中均含有連翹酯苷A,且含量相差無幾,但Q2 比Q3有較強的AChE抑制活性。推測出現這種情況的原因可能為Q2中連翹酯苷A,蘆丁和提取液中一些其他成分(連翹酯苷I、連翹酯苷B等)協同作用于AChE,增強了對AChE活性的抑制作用,根據上面實驗結果,我們得到20%乙醇洗脫物對AChE的抑制效果較好,推測連翹酯苷A可能是其中的一種有效作用成分。

Q1, Q2, Q2, Q3, Q4, Q5 and Q6 represent water wash, 20%, 40%, 60%, 80% and 95% ethanol,respectively.A: Forsythoside I; B: Forsythoside B; C: (+)-pinoresinol-β-D-glucoside;D:Forsythiaside; E: Rutin; F: Phillyrin; G: Phillygenin.Fig.1 Liquid phase diagram of different extractsQ1,Q2,Q3,Q4,Q5和Q6分別代表0%,20%,40%,60%,80%和95%乙醇。A:連翹酯苷I;B:連翹酯苷B;C:(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷;D:連翹酯苷A;E:蘆丁;F:連翹苷;G:連翹脂素。圖1 不同乙醇濃度洗脫物的液相分析圖

連翹酯苷I連翹酯苷B(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷連翹酯苷A蘆丁連翹苷連翹脂素 Q2峰面積767.27170.6482.442 918.9542.21--百分比/%18.114.031.9568.911.00-- Q3峰面積494.90132.09338.492 925.9576.71235.3165.99 百分比/%11.403.047.8067.391.775.421.52 Q4峰面積39.07-38.85204.60-779.5032.48 百分比/%3.14-3.1216.46-62.701.92

2.2 青翹主要成分對AChE酶活的抑制作用比較

圖2是連翹酯苷A和蘆丁對AChE酶活的抑制作用圖。由圖可知,隨連翹酯苷A濃度(5～400 μmol/L)和蘆丁濃度(20～650 μmol/L)的增大,連翹酯苷A和蘆丁對AChE的抑制作用均逐漸增強。其中連翹酯苷A對AChE酶活的抑制(IC50值為(45 ± 0.58)μmol/L)作用強于蘆丁對AChE酶活的抑制(IC50值為(242 ± 2.91)μmol/L)。連翹脂素和連翹苷對AChE酶活幾乎沒有抑制作用,數據未顯示。通過IC50比較,可以得出連翹酯苷A對AChE酶活的抑制作用最強。

Data are represented as means ± SEM (n=3)Fig.2 Forsythiaside (A) or rutin (B) inhibited AChE activity數據表示為means ± SEM(n=3)圖2 連翹酯苷A(A)和蘆丁(B)對AChE的抑制作用

圖1中,Q3的主要成分比Q2多了連翹苷和連翹脂素,但連翹苷和連翹脂素對AChE酶活幾乎沒有抑制作用,同時連翹酯苷A含量相近,所以Q3和Q2對AChE酶活的抑制作用相似。Q4的主要成分比Q2多了連翹苷和連翹脂素,但連翹酯苷A含量急劇降低,同時蘆丁幾乎不存在于Q4,而蘆丁對AChE酶活也有較強抑制作用,所以Q4相比Q2對AChE酶活的抑制作用大幅降低。由此推測,連翹酯苷A是抑制AChE酶活的主要成分之一。

2.3 剩余物和混合物抑制AChE酶活研究

圖3是Q2,敲除的連翹酯苷A和剩余物的液相分析圖。Q2中,保留時間在28.6 min的峰(即圖中D代表的峰)是連翹酯苷A;敲除的連翹酯苷A的液相分析圖中,保留時間在28.8 min的峰(即圖中D代表的峰)是連翹酯苷A,峰面積占比是100%,說明敲除部分完全是連翹酯苷A;剩余物的液相分析圖中,保留時間在29 min的峰(即圖中D代表的峰)是連翹酯苷A,峰面積是43.32,峰面積占比是0.92%,因此可以判斷出,Q2中的連翹酯苷A基本敲除完全。

A:Forsythoside I; B: Forsythoside B; C: (+)-pinoresinol-β-D-glucoside; D:Forsythiaside; E: Rutin.Fig.3 Liquid phase diagrams of Q2, the knockout forsythiaside and remainderA:連翹酯苷I; B:連翹酯苷B; C:(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷; D:連翹酯苷A; E:蘆丁圖3 Q2部分,敲除的連翹酯苷A部分和剩余物部分的液相圖

圖4是連翹酯苷A標品的標準曲線圖,根據標曲圖計算出Q2和剩余物中連翹酯苷A濃度分別為0.26和0.007 mg/mL。為了驗證連翹酯苷A是Q2中抑制AChE酶活的一種主要成分,根據Q2中連翹酯苷A與剩余物部分的占比,配制混合物,比較Q2、剩余物部分和混合物對AChE酶活的抑制作用。結果(圖5)表明,隨著濃度(0.2～1.2 mg/mL)的增大,剩余物和混合物對AChE的抑制作用都呈現增強的趨勢。但和Q2相比,因為蘆丁的存在,所以剩余物對AChE的抑制作用(IC50值為(0.52 ± 0.002) mg/mL)只有部分降低;而混合物中由于連翹酯苷A的重新加入,其對AChE的抑制(IC50值為(0.44 ± 0.003) mg/mL)作用與Q2的作用相當。推測出現這種情況的原因可能為將連翹酯苷A敲除后剩余成分由于協同作用,對AChE仍有抑制作用。又由于連翹酯苷A具有抑制AChE活性,所以混合物的抑酶活性略強于敲除后剩余部分。所以,最終確定連翹酯苷A是Q2中的一種有效作用成分。

Fig.4 Standard curve of forsythiaside.圖4 連翹酯苷A標準品的標準曲線圖

Data are represented as means ± SEM (n=3)Fig.5 Inhibitory effects of remainder (A) and mixture (B) on AChE.數據表示為means ± SEM(n=3)圖5 剩余物(A)和混合物(B)對AChE的抑制作用

3 結論

本文主要利用Ellman法系統地考察青翹的不同濃度乙醇洗脫物(Q1,Q2,Q3,Q4,Q5和Q6)以及主要成分(連翹酯苷A,蘆丁,連翹苷和連翹脂素)對AChE的抑制作用。結果表明,Q1,Q2,Q3,Q4,Q5和Q6對AChE的抑制作用研究中,Q2抑酶活性較高;青翹主要成分對AChE的抑制作用相比,連翹酯苷A對AChE的抑制作用強于蘆丁,而連翹脂素和連翹苷對AChE的幾乎沒有抑制作用;結合液相圖(Q2中連翹酯苷A的峰面積占比較大),我們推測連翹酯苷A在其中發揮了重要作用。根據敲除實驗,證實連翹酯苷A是青翹中的一種有效作用成分。