蘭科植物的起源和進化

陸祥家, 蘭思仁, 蔡文杰, 劉仲健,6

(1.福建農林大學蘭科植物保護與利用國家林業和草原局重點實驗室，福建 福州 350002;2.福建農林大學園林學院，福建 福州350002;3.臺灣成功大學蘭科植物研究和發展中心，臺灣 臺南 701;4.臺灣成功大學熱帶植物科學研究所，臺灣 臺南 701;5.臺灣成功大學生命科學學院，臺灣 臺南 701;6.華南農業大學林學院，廣東 廣州 510640)

被子植物又名開花植物或有花植物，起源于早白堊紀或更早時期，在白堊紀末期(6 500年前)發生大量的輻射適應后，它們占據了幾乎所有的生境[1].古植物學及分子系統發生學與分支學兩大領域的研究徹底改變了植物學家對植物進化的理解[2].作為被子植物最大的科之一，蘭科分為5個亞科，有超過28 000個種[3].蘭科植物如何進化出如此豐富的多樣性，必須結合最新的基因組數據、化石及分子生物學技術進行相關研究，以加深對蘭科植物進化過程的了解，從而對被子植物進化有進一步的理解.因此，研究蘭科植物的起源和進化是植物學研究中的重要課題.

蘭科植物的多樣性體現在花形態的起源與進化上，花部發育是受MADS-box基因家族的調控.古老起源的MADS-box基因編碼了一個長度為55～60個氨基酸的高度保守的MADS(MCM1/AGAMOUS/DEFICIENS/SRF)結構域.MADS-box基因通過全基因組復制(whole gene duplication, WGD)在有花植物中擴增，并參與開花時間、花器官分化、果實發育和植株發育的調控[4-5].MADS-box基因家族的古老起源和進化，對植物的繁殖器官，特別是蘭科植物花的形態建成尤為重要.因此，MADS-box基因家族成為蘭科植物進化研究的重要對象.本文將重點介紹蘭科植物基因組的研究進展，并揭示MADS-box基因家族在蘭科植物花形態建成和進化中的作用.

1 現存蘭科植物的起源

1.1 古生物學研究結果

第一個被發現的蘭科植物化石的花粉塊以附著在Proplebeiadominicana(一種滅絕的無刺蜂)胸背上的方式，被保存在多米尼加共和國的15～20百萬年前的中新世琥珀中[6]；之后，另一個更古老的蘭科植物化石被發現在中新世波羅的海的40～45百萬年前的琥珀中[7].然而，分子系統進化樹研究表明，現存蘭科植物的最近共同祖先可能早在76～84百萬年前的白堊紀晚期就已出現[5].而結合蘭科生物地理學和系統發育推測，蘭科植物最早出現在112百萬年前的澳大利亞[8].總之，目前已知的蘭科植物化石仍然稀少，且比理論上的蘭科植物共同祖先更為年輕.因此，蘭科植物的起源仍然是一個謎，而通過蘭科植物基因組學的研究為探索其起源和進化提供新方法.

1.2 基因組學研究結果

作為植物學研究中的一種寶貴資源，基因組序列可以通過比較基因組學的研究探討植物進化的問題，也為蘭科植物的起源和進化提供了技術支撐和借鑒.在植物中，擬南芥(Arabidopsis)的全基因組在2000年首次通過Sanger法完成測序，該方法使用了細菌人工染色體(BAC)、噬菌體(P1)和具有轉化能力的人工染色體(TAC)文庫來進行測序[9].繼擬南芥之后，又以此相同的方式對另外3種植物(水稻、高粱和玉米)的基因組進行了測序[10-12].隨著計算機科學的發展，測序技術及用于組裝大量測序數據算法的進步，次世代測序技術在測序植物基因組方面變得更受歡迎和更為經濟實惠[13].近年來，第3代測序技術已經可得到平均長度為20 kb的長讀長數據，為克服復雜和多倍體植物基因組組裝提供了幫助[14-15].到目前為止，大約有200種植物已經進行了基因組測序與組裝，其中包括模式和非模式植物[16].這些技術和成果促進了蘭科植物基因組學的研究.蘭科植物中3個物種(小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsisequestris、鐵皮石斛Dendrobiumcatenatum和深圳擬蘭Apostasiashenzhenica)高質量的參考基因組已經完成了測序與組裝[17-19].這些基因組數據結合蘭科植物化石證據為推測蘭科植物的起源和演化歷史提供了新的方法.

1.3 蘭科植物的起源

現存蘭科植物的5個亞科分別為擬蘭亞科(2屬17種)、香莢蘭亞科(15屬180種)、杓蘭亞科(5屬130種)、樹蘭亞科(500多屬24 000種)和蘭亞科(208屬3 630種)[3,19].不像其他蘭科亞科的花那樣具有兩側對稱、唇瓣(修飾的花瓣)、蕊柱(雄蕊和雌蕊融合生成的合蕊柱)和花粉塊(粘合成的花粉粒)，擬蘭亞科的花具有輻射對稱的花被，沒有完全特化的唇瓣；具有3個雄蕊，部分與雌蕊合生形成相對簡單的合蕊柱和粉狀花粉[19-20].此外，系統發生學研究表明，擬蘭亞科通常被認為是蘭科的基部類群[21-22].因此，擬蘭亞科被認為比其他現存的蘭科亞科起源更古老.解決現存蘭科植物起源之謎的可能方法之一就是能夠將擬蘭亞科與其他蘭科亞科基因組之間進行對比研究.而覆蓋所有蘭科亞科的12種蘭科植物的旁系同源基因中的每個同義位點(Ks)的同義取代分布顯示了Ks為0.7～1.1，這反映了蘭科植物存在一次WGD事件.蘭科植物與蘆筍Asparagusofficinalis(蘭科植物近緣科的物種)之間的旁系同源物和直系同源Ks分布的比較結果表明，這次WGD事件僅存在于蘭科植物的共同祖先中.結合共線性分析和同線性分析的結果表明，蘭科植物這一特異性WGD事件發生在白堊紀/古近紀的分界線附近.現存蘭科植物的共同祖先發生WGD后，隨即在短期內通過基因的丟失或擴張，分化為5個亞科，其中，擬蘭亞科丟失的基因最多.這些結果暗示著擬蘭亞科可能不是蘭科最古老的類群，也許只是擁有更為古老的性狀而已.基于5個現存的蘭科亞科從一個共同的祖先獨立進化而來的觀點，那么，若將WGD后設定為現存蘭科植物基因組進化的一個基點，可以認為：(1)未發生WGD前的蘭科植物祖先，其基因組大小只是發生WGD后蘭科植物的一半.因此，未發生WGD前的蘭科植物與現存的蘭科植物在形態上將存在重大差異.(2)現存蘭科植物的祖先在發生WGD后擁有最完整的遺傳信息，隨即開始基因的丟失或擴增，開啟了現存蘭科植物的進化起點.(3)現存的蘭科植物主要在發生WGD后，不同的蘭科植物通過特異的基因丟失和擴張進而分化為5個亞科.在5個亞科中，擬蘭亞科丟失的基因最多，而樹蘭亞科丟失的最少.因此，樹蘭亞科的基因組最接近蘭科植物的共同祖先在發生WGD后的基因組，并可能保留了比較多當時的特征.而擬蘭亞科丟失的基因最多，其形態可能更接近發生WGD前的蘭科植物祖先特征.

基于蘭科植物WGD后的基因組信息，相對于蘭科的分子系統進化樹[23]，頂部的類群擁有基因組信息與發生WGD時最為相近，而基部的類群與發生WGD時差別最大，更接近WGD前的蘭科植物.基因組分析結果顯示，WGD后先形成蘭科植物的兩側對稱性(唇瓣的出現)，隨后由于調控唇瓣發育基因的丟失導致唇瓣演化為“花瓣”，產生了輻射對稱性的擬蘭亞科的花.因此，WGD后蘭科植物可能從兩側對稱演變為輻射對稱.兩側對稱的蘭科物種促進傳粉?；缘男纬梢愿舆m應新生境，從而分化出更多的物種.受蘭科植物進化路徑的啟發，被子植物的進化可能具有與蘭科植物相似的模式：現在所有被子植物的科幾乎同時都出現在白堊紀晚期，它們幾乎都發生了與蘭科植物相似的WGD[24].現存被子植物的前祖先發生了WGD，躲過了白堊紀晚期的大滅絕事件后，占據滅絕物種留下的生態位而產生大量的輻射適應.這為現存的被子植物突然在白堊紀晚期發生物種大量輻射適應，而之前很少出現的“達爾文進化之謎” 提供了一種解釋.因此，在追蹤被子植物的起源，追溯它們的前祖先時不應該只以現在的被子植物的形態作為參考標準，它們有可能具有截然不同的形態.

2 蘭科植物形態的進化

正如前面所述，擬蘭亞科與其他4個亞科在形態上有很大的差異，特別是在花的唇瓣、蕊柱和花粉形態上明顯不同.通過對深圳擬蘭與其他蘭科植物以及被子植物基因組的比較，發現蘭科植物有474個特有基因家族.因此，得以重建一個蘭科植物祖先的基因工具包和基因池，并可從中窺視蘭科植物新的基因家族及其擴張和收縮的進化歷史，特別是調控蘭科植物開花的MADS-box基因“生”與“死”的歷史蹤跡，從而揭示了唇瓣、合蕊柱、花粉塊、無胚乳種子的發育及地生與附生習性進化的分子機制.

2.1 MADS-box基因家族和蘭科植物花部形態的進化

圖1 MADS-box基因家族在蝴蝶蘭中的表達模式Fig.1 Expression pattern of MADS-box genes in Phalaenopsis perianth

蘭科植物演化成一個很獨特的類群[22]在于它的花部器官的構成：3枚萼片、3枚花瓣(其中一枚特化為唇瓣)和合蕊柱[19].MADS-boxⅡ類基因家族包括E類、C/D類、 B-AP3和AGL6基因家族，比其他物種有更多套基因.這些擴張的基因家族調控了蘭科植物花部器官的發育[25-29](圖1).

合蕊柱是蘭科植物花部構成的一個標志性的器官，經分析和驗證的結果顯示，合蕊柱的發育由一個C類基因 PeMDAS1和一個D類基因PeMADS7所調控[30-31].蝴蝶蘭基因組數據的應用，已鑒定MYB基因調控花的顏色的形成[31]以及TCP基因調控胚珠的發育[32].

唇瓣(修飾的花瓣)可以吸引傳粉者并為其提供采蜜時的“著陸平臺”[33-34]，然而，深圳擬蘭具有一個未分化的唇瓣和輻射對稱的花被(圖2).MADS-box中的B-AP3和E類基因參與調控其唇瓣的形成[17,35-36].在深圳擬蘭、小蘭嶼蝴蝶蘭和鐵皮石斛中分別有2、4、4個B-AP3基因和3、6、5個E類基因. B-AP3和E類基因的數量均在深圳擬蘭中減少.B-AP3基因的進化樹和共線性分析表明，B-AP3和E類基因在現存蘭科植物的共同祖先中擴增，而深圳擬蘭丟失了B-AP3和E類同源基因而不能形成特化的唇瓣，導致花被恢復到祖先狀態(圖3)[19].

a：擬蘭屬的花；b：蝴蝶蘭屬的花.圖2 蘭科植物的花部形態Fig.2 The morphology of orchid flowers

圖3 參與蘭科植物形態進化的MADS-box基因Fig.3 MADS-box genes involved in the morphological evolution of orchids

2.2 蘭科植物的塵狀種子和多樣化

種子形成于植物的繁殖階段，無論是裸子植物還是被子植物均是這樣.一般來說，種子中發芽的營養物質通常儲存在胚乳中.然而，蘭科植物種子僅含有胚芽，沒有胚乳和其他明顯的組織分化.未能形成功能性的胚乳會導致在單個蒴果內含有大量微小種子(稱為粉狀種子)[37].MADS-boxⅠ類基因在種子發育中起關鍵作用，特別是在胚乳發育的早期階段和指定雌配子體時期[38-40].MADS-boxⅠ類基因可分為3類：Mα、Mβ和Mγ. Mα和Mγ MADS-box基因在小蘭嶼蝴蝶蘭、深圳擬蘭和大葉仙茅Molineriacapitulata的種子發育過程中表達[19].然而，Mβ MADS-box基因不存在于蘭科植物基因組中，包括小蘭嶼蝴蝶蘭、深圳擬蘭和鐵皮石斛，但在擬南芥、毛果楊Populustrichocarpa、水稻Oryzasativa和大葉仙茅中發現[19].因此，丟失的Mβ MADS-box基因可能與蘭科植物的種子沒有胚乳相關[18]，從而形成微小的種子[33].蘭科植物進化出沒有胚乳的種子，而將能量用于更多種子的產生致使一個果實可達幾萬個種子，同時，變小的種子更容易傳播以占領新生境形成新物種.

蘭科植物種子缺乏營養來源(胚乳)，迫使蘭科植物種子以獨特的方式發芽.蘭科植物種子發芽后在葉片發育成熟之前，劫持了共生菌根真菌并吸收共生真菌的營養物質[41].有趣的是，胚乳中后合子的雜交屏障是植物中主要的雜交障礙類別之一[42-43].即使是不發育胚乳的蘭科植物種子，它也可能在蘭科植物中引起低強度的種間雜交障礙[44].蘭科植物，如小蘭嶼蝴蝶蘭進化出自交不親和的繁殖系統，是由于在其基因組的雜合區存在大量的雜合子所致[17].然而，缺乏較強的種間雜交障礙和雜合區在多種蘭科植物中發現，如陰生紅門蘭[45]、紅門蘭[46]、眉蘭[47-48]和樹蘭[49-50]，且在東南亞的兜蘭種群中證實了網狀進化[51].因此，推測種間雜交和屬間雜交在蘭科植物物種多樣性的演變中起著重要作用.

2.3 花粉塊的形成

花粉塊是一種花粉粒粘合成塊的組織，在蘭科和蘿藦科中獨立進化，可以附著在授粉昆蟲身上以便傳播，在該種群的輻射分布方面發揮作用[52-53].在維管束植物中，MIKC*MADS-box基因(包括P-和S-亞類基因)在花粉成熟過程中的雄配子體發育中的功能是相當保守的[53-54].除了具有散生花粉粒的深圳擬蘭，P-亞類基因已經在蘭科植物中丟失[19].相比于其他4個亞科具有龐大的物種(從180種到超過24 000種)，現存擬蘭亞科僅有少量物種(17種).因此，其他亞科的蘭科植物MIKC*MADS-box基因中P-亞類成員的丟失被認為導致花粉塊的進化(圖2)[55].花粉塊的形成，是蘭科進化史上的一項關鍵創新，在促進蘭科植物新物種的形成上起重大作用.這是由于花粉塊形成后產生了花朵間一對一的傳粉模式，促成了生殖隔離從而有助于新物種的形成.不像擬蘭亞科那樣，一朵花的花粉可以散播給許多朵花而造成后代同質化.

2.4 蘭科植物附生習性和景天酸代謝的進化

許多蘭科植物具有附生習性，它們不在地面上生長，而是附生于其他植物(通常是樹木)、巖石和任意固態物上.附生性蘭科植物可更接近陽光和/或進入幾乎沒有競爭的領地[16-17].附生性蘭科植物的根部有一些特殊的適應性構造，包括海綿表皮和根膜，以幫助它們緊貼樹木，從雨水和空氣中收集水分和養分[20,56-57].擬南芥中的AGL12基因調控根分生組織的細胞增殖而分化出地生根，而絲葉貍藻Utriculariagibba由于缺乏AGL12相似基因，沒有形成真正意義上的根[58-59].附生種類的蘭科植物也沒有AGL12相似基因，但地生的深圳擬蘭含有一個在根部高度表達的類似AGL12基因.此外，與根相關的MADS-box基因亞家族ANR1在附生蘭(小蘭嶼蝴蝶蘭和鐵皮石斛)中也減少[19].功能性四聚體復合物的形成是花器官特定MADS-box蛋白的顯著特征[59].兩種花被特定基因(B-AB3和E類)及兩種與根發育相關的MADS-box基因(AGL12和ANR1)分別在深圳擬蘭和小蘭嶼蝴蝶蘭中一起丟失(圖3).因此，推測AGL12和ANR1基因可能參與類似于B-AP3和E類的功能性復合物的合成.當這些基因丟失時，參與復合物形成的其他基因則不能發揮更多功能，致使蘭科植物生長出氣生根，從而進化出蘭科植物的附生特征.另一方面，調控景天酸代謝的基因(α碳酸酐酶)明顯擴張致使蘭科植物進化出景天酸代謝功能[17,29,60-62]，促進了附生習性的產生.鐵皮石斛大量抗性基因(R-基因)的擴張和多糖合成通路的進化使它能適應不同的生態條件而有較為廣闊的分布區[18].這種附生特性的形成，可使蘭科植物利用其他植物所不能利用的生境進行生長.這些生境之間存在很大差異，容易隔斷蘭科植物物種的基因交流(即生境隔離)，有助于促進新物種的產生.

3 結論和展望

比較基因組學是研究物種進化的一種非常有用的技術方法.通過比較擬蘭亞科和樹蘭亞科完整的高質量參考基因組，揭示現有的蘭科植物是從一個共同祖先進化而來的，它在白堊紀后期發生WGD后開啟了現存蘭科植物的起源，隨后在較短的時間內通過基因的丟失和擴張分化出5個亞科.蘭科植物獨特形態的進化是由相關基因參與調控所致.因此，在此基礎上開展對尚未有全基因組數據的香莢蘭亞科、杓蘭亞科和蘭亞科的3個亞科物種參考基因組的測序，將有助于全面了解蘭科植物的進化及形態多樣化形成的分子機制.