牙本質在骨組織工程學中的應用

肖聞瀾， 胡琛，2， 榮圣安， 朱宸佑，2， 伍穎穎，2

1.四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫學研究中心，四川成都（610041）； 2.四川大學華西口腔醫院種植科，四川成都（610041）

牙周疾病、腫瘤、外傷等均可造成口腔硬組織的缺損。為了實現骨組織的再生，組織工程學是一個很有前景的治療方向［1］。結合生命科學和工程學的原理和技術，以生物材料為支架，搭載患者自身的干細胞，聯合生長因子進行移植，可以在修復組織的同時減少免疫排斥、病原體轉移等問題［2］。牙本質是一種很有潛力的生物材料，它的無機、有機成分構成與骨組織類似。無機成分以羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）為主，有機成分以I型膠原為主，這些成分均為制備支架的常用物質。另外，牙本質本身含有多種生長因子［3］。近年來，牙本質在骨組織工程學中的應用引起了很大關注。

1 牙本質的組成概述

人牙本質由65%的無機成分與35%的有機成分構成，無機成分以HA為主［4］。需要注意的是，牙本質中HA的含量和結晶程度與其所在部位有很大關系。相較于牙冠部分，牙根部牙本質由結晶度更低、Ca/P更小的磷酸鹽構成，因此與自體骨具有更加接近的理化性質［5］。

近90%的牙本質有機成分由I型膠原構成［6］。這種3股超螺旋結構的膠原相互交聯形成網架狀結構，容納沉淀于其中的礦化結晶以及其他有機組分，包括非膠原蛋白（noncollagenous proteins，NCPs）、蛋白多糖、脂質等［7］。NCPs大致可以分為兩類，第一類包括牙本質磷蛋白（dentin phospho?protein，DPP），牙本質涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）及牙本質基質蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）。從前認為這類NCPs由成牙本質細胞合成，僅存在于牙本質基質中，為牙本質特異性蛋白。但是，最近也有很多研究在骨等礦化組織中發現它們［8］。另一類NCPs定位于牙本質、牙骨質、骨組織的細胞外基質，包括骨涎蛋白（bone sialo?proteins，BSP）、骨鈣蛋白和骨鈣素（bone gla?pro?tein，BGP），NCPs在牙本質和骨組織的礦化過程中均起到重要作用［9?10］。牙本質中貯藏有豐富的生長因子與生物活性分子。如骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），這種糖蛋白定位于牙本質、牙骨質與骨組織的細胞外基質，被證實可誘導間充質干細胞向軟骨和骨組織分化［11］。胰島素樣生長因子（insulin?like growth factor，IGF），血小板衍生生長因子（platelet?derived growth factor，PDGF），成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）也被發現存在于人牙本質基質中［12］。牙本質的組成結構賦予了它在組織工程學中承擔各種角色（支架、生長因子來源等）的潛能，接下來本文將闡述牙本質的各種應用方式。

2 牙本質在組織工程學中的應用

2.1 脫蛋白質

脫蛋白質加工的出發點在于發揮HA等磷酸鈣的支架作用。對于HA類生物材料來說，高孔隙率和足夠的孔徑是有效促進骨再生的重要因素，多孔區域允許血管化和細胞浸潤［13］。牙本質原本是致密的礦化組織，去除蛋白質后可以提高其孔隙率。Fichant等［14］對牙本質進行脫蛋白質處理，掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察到材料表面除牙本質小管的天然孔隙之外，出現了膠原纖維消失后形成的新孔隙，這種新孔隙使材料的總體孔隙度增大到約20%。脫蛋白后，牙本質的彈性模量、硬度等機械性能有所下降，與已經在組織工程學中用作支架的珊瑚外骨骼材料的性能接近。研究者認為這些結果展現了脫蛋白牙本質作為支架的潛能。Tabatabaei等［15］比較了脫蛋白、脫礦和天然牙本質材料，在模擬體液中，SEM顯示脫蛋白牙本質組具有最高的HA晶體形成速率，培養的人牙髓干細胞也在脫蛋白牙本質表面顯示出更好的細胞黏附、活力和分化情況。

脫蛋白牙本質或許可作為一種合適的支架，但是這種方法仍然有爭議，很多研究者認為NCPs、生長因子等對于牙本質促進骨再生的作用是必須的。目前運用較為廣泛的脫蛋白方法是使用質量分數為2.6%的NaOCl溶液于37℃下浸泡樣品，使用搖動平臺持續混合，每天換液一次，總流程持續 14 d［16］。

2.2 脫礦

脫礦處理是目前研究較多的一種方式。這種方式保留膠原纖維，通過去除部分礦物質提高孔隙率。Kim等［4］分析了脫礦與未脫礦牙本質的組成結構，X線能量色散譜顯示脫礦牙本質由Ca/P比較小、結晶度較低的磷酸鹽構成，SEM顯示脫礦牙本質小管直徑更大，伴有膠原纖維的網狀暴露。這些改變有利于增強骨組織再生材料的兩種重要性能，即骨傳導性和骨誘導性。牙本質的骨傳導性與無機成分結晶度呈負相關，高結晶度的磷酸鈣往往難以由破骨細胞直接降解，在移植部位吸收緩慢，反之脫礦牙本質結晶度低，易降解［17］。Bono等［18］將MG63和SAOS?2細胞接種至脫礦牙本質材料表面，觀察到了顯著的細胞黏附與增殖，這表明了脫礦牙本質優秀的骨傳導性。脫礦牙本質骨誘導性的增強則與各種生長因子容易通過增寬的牙本質小管釋放有關。以目前研究較多的BMP?2為例，脫礦牙本質可以作為儲藏庫，在移植后不斷釋放BMP?2，募集和誘導未分化細胞向骨組細胞分化。Kim等［19］在裸鼠背部的皮下組織植入脫礦牙本質，在植入位點發現了新骨形成，證實牙本質具有骨誘導性。

由于這兩種性能，研究者們不僅關注脫礦牙本質的支架作用，還在考慮其作為生長因子來源的可行性。還有學者認為，將重組骨形態發生蛋白（recombinant human BMP?2，rhBMP?2）搭載至脫礦牙本質將獲得更好的效果［20］。Kim等［21］在骨缺損模型中，通過聯用脫礦牙本質與rhBMP?2實現了與自體骨接近的新骨形成水平。

在技術上，目前運用的脫礦方式非常多樣。一般認為由于酸性物質對有機成分的影響，過度脫礦是不利的。Li等［22］提出運用5%、10%、17%濃度的EDTA逐級脫礦牙本質，從而保留蛋白質等有機成分的方案。楊禾豐等［23］在這種脫礦牙本質表面成功觀察到了骨髓間充質干細胞的增殖及成骨分化。Tabatabaei等［15］也在其體外實驗中得到了相似的結果。

2.3 提取非膠原蛋白

在組織工程學領域，運用人體或非人體組織的提取物是很常見的做法?？紤]到牙本質中非膠原蛋白的豐富含量，單獨提取NCPs，再聯合其他支架材料是一個可行的選擇。NCPs被證實參與調控骨的形成，控制未分化細胞的黏附、增殖和分化，以及羥基磷灰石的成核與膠原蛋白的礦化等。DPP是牙本質基質中最豐富的非膠原蛋白，被證實參與生物礦化過程初始階段HA結晶的成核［24］。DSP可作為一種配體，通過誘導未分化的間充質細胞內的信號傳導級聯反應，指導其分化［25］。DSP通過加速成骨細胞增殖以及隨后的成骨細胞分化來促進骨的形成［26］。在DMP1的環境下培養人牙周膜干細胞，通過堿性磷酸酶染色和von Kossa硝酸銀染色觀察向成骨細胞的分化，DMP1處理組分化程度明顯高于無DMP1的對照組［27］。因此，NCPs被視為一種很有前景、可搭載至支架的生物活性分子。

目前從牙本質中分離NCPs的過程基本遵循三步法，三步依次使用鹽酸胍、EDTA溶液、鹽酸胍，每一步分別提取非礦化成分中的、緊鄰和結合HA的、以及其他剩余的 NCPs［28］。

3 小結

目前，各種形式的牙本質材料已在體外和體內實驗中展現了其有效性與安全性。牙本質含有磷酸鹽、膠原蛋白、生長因子等成分。脫蛋白加工可得到高孔隙率、大孔徑的以HA為主的支架材料；脫礦加工可得到兼有膠原和HA，且搭載多種生長因子的多功能材料；提取NCPs加工可以得到生物活性分子，用于交聯、改性其他材料。因此，在骨組織工程學的探索中，可以考慮將牙本質作為一個合適的選擇。但是，牙本質材料的應用仍有許多問題。各種加工方式得到的牙本質材料的優劣勢還需要分析，每種制作工藝還需要優化，這些都需要進一步的研究來完善。