荷葉堿的分離純化與HPLC檢測

李 楊，吳 嬌，朱釗銘，劉 驍，石玉生，李春斌

(1.大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116605;2.桂林醫學院第二附屬醫院，廣西 桂林 541199)

荷葉即睡蓮科植物蓮(NelumbonuciferaGaertn)的葉，其主要組成部分有葉片、葉柄和荷蒂(即葉片與葉柄相接的部分)。蓮屬植物雖然種類少但分布極其廣泛，除青海、西藏等西北地區以外，全國各地均有分布，并主要集中在長江、黃河和珠江三大流域，其中以浙江、江蘇、湖南、湖北等地為主。傳統醫學認為，荷葉性平、味苦，歸脾、肝、胃經，具有清熱解暑，涼血止血，生發清陽的功效[1]?！侗静菥V目》上有明確記載“荷葉服之，令人瘦劣，單服可消陽氣浮腫之氣”、“生發元氣，禪助脾胃，澀精濁，散淤血，消腫痛，發痘瘡”。在2002年初監發的中華人民共和國衛生部的衛法〔2002〕51號文件中，荷葉被列入“既是食品又是藥品”的名單之中[2]。

荷葉堿(Nuciferine)是一種阿樸啡類生物堿，是荷葉生物堿中主要成分之一，在國際上規定 80%以上的純度的荷葉堿即為高純度荷葉堿，目前國內的荷葉堿制備水平較低，主要依賴國外進口高純度荷葉堿[3]。高純度荷葉堿晶體為白色，純度越高顏色越接近白色，荷葉堿可溶于酸水，甲醇等有機溶劑，不溶于堿水，分子式 C19H21NO2，分子量 295.376[4]，結構式如圖1。

圖1 荷葉堿的化學結構式

荷葉生物堿大部分呈弱堿性，在水中的溶解性較差，一般以游離態的形式存在，但能很好地溶解于氯仿、乙醚、乙醇、甲醇等有機溶劑。由于生物堿在偏酸性條件下能生成可溶性鹽，因此能溶于偏酸性的水溶液。在此前提下，荷葉中生物堿類物質的提取一般采用有機溶劑法，為了提高得率，一般輔助以超臨界萃取、超聲波萃取、微波萃取等方式。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

實驗原材料荷葉購于鳳城市仁和中藥飲片有限責任公司。實驗過程中所用試劑均購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

主要實驗儀器：UV2450型紫外可見光譜儀(日本島津)；IRPrestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津)；LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津)。

1.2 方 法

1.2.1 荷葉總生物堿的提取

根據生物堿適用酸提堿沉的原理，本實驗中荷葉堿的提取采用了在50%乙醇提取溶液中加入稀鹽酸調pH的方法[5]，用TLC法檢測結果。

用電子天平準確稱取20.0 g荷葉粉末，倒入兩口圓底燒瓶中。用膠頭滴管向50%乙醇溶液中緩慢滴加0.2%HCl溶液，調至pH=2.0，量取200 mL溶液倒入荷葉粉末中，60 ℃水浴回流提取2 h[6]。提取完成后，提取液過濾，保存過濾后的提取液，殘渣按照上述步驟再次提取，收集合并提取液。提取液減壓濃縮后得總生物堿浸膏[7]，稱量得到的黑色浸膏為1.45 g，浸膏得率為7.25%。

以三氯甲烷：無水乙醇=10∶1為展開劑，以荷葉堿標準品作為對照進行TLC檢測并記錄。

1.2.2 荷葉堿的陽離子交換樹脂純化

據文獻報道[8]，用離子交換樹脂進行柱色譜分離荷葉堿效果較好，本實驗先用強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂進行荷葉堿分離的實驗。

總生物堿浸膏用pH=2.0的50%乙醇溶液溶解，洗脫液為氨水：無水乙醇：去離子水=3∶40∶57。樣品以5 ml·min-1的流速動態上樣，用錐形瓶采集下方漏出液。上樣完成后，用上述配制的洗脫液以5 ml·min-1的流速洗脫。待洗脫液有氨水味道時開始收集洗脫液，而且對洗脫液進行TLC檢測。收集含有荷葉堿的洗脫液，以荷葉堿標準品為對照，進行紫外光譜檢測。洗脫液經減壓濃縮后得荷葉堿粗品，因荷葉堿粗品中還含有無機鹽、蛋白質等雜質，需對粗品進行萃取，萃取溶劑為石油醚。用超聲波清洗機進行萃取[9]，萃取時間為30 min，溫度60 ℃，同樣條件萃取兩次，收集萃取液。

1.2.3 荷葉堿的大孔吸附樹脂純化

將荷葉總生物堿浸膏采用HPD-100大孔樹脂進行柱色譜分離[10]，用50%～70%的乙醇溶液梯度洗脫。收集各梯度洗脫液并進行TLC檢測，至洗脫液中加碘化鉍鉀無桔紅色沉淀，減壓濃縮成浸膏，得到純化后的總生物堿。

1.2.4 荷葉堿的硅膠柱層析純化

多次試驗證明用樹脂進行柱色譜分離并不能使荷葉堿單獨分離出來，但是能得到初步純化的總生物堿。因此在用樹脂純化獲得總生物堿的基礎上，對荷葉總生物堿進一步進行硅膠柱色譜的分離。

通過TLC法確定流動相及其比例為，二氯甲烷：甲醇=30∶1-20∶1。稱取硅膠(100-200目)330 g，置于大燒杯中，用適量流動相浸泡，并用玻璃棒攪拌至無氣泡，將硅膠倒入層析柱中，使硅膠床面平滑，流動相沖洗硅膠至干凈[7]。將樣品上樣，加流動相進行洗脫，流速為3 ml·min-1。根據薄層板情況更換流動相比例，至洗脫液加入碘化鉍鉀無桔紅色沉淀生成。

1.2.5 紫外吸收光譜的檢測

準確稱量荷葉堿標準品溶于一定量的乙醇溶液中，以乙醇為空白對照，在200～700 nm范圍內進行紫外可見分光光度的掃描，將提取的樣品的紫外掃描圖譜與荷葉堿標準品的圖譜進行比較與分析。

1.2.6 紅外吸收光譜的檢測

取KBr粉末200～250 mg在瑪瑙研缽中充分研磨，將研磨好的物料置于壓片模具中鋪勻，合上模具置壓片機上加壓至80 MPa，壓片3 min左，取少量配置好的0.1 mg·mL-1的荷葉堿標準品溶液均勻滴加在溴化鉀片上，將樣品架置于光譜儀中檢測。荷葉堿提取物的檢測方法同上，將提取的荷葉堿與標準品的紅外光譜圖進行對比與分析。

1.2.7 高效液相色譜的檢測

(1)標準溶液配制。分別精密稱取荷葉堿標準品和自制樣品粉末2.50 mg，置25 mL容量瓶中，用乙腈(色譜純)溶解并定容至刻度，其它幾種低濃度的荷葉堿標準品用乙腈稀釋制得。

(2)液相色譜條件。用于檢測樣品的色譜柱為OP C18-101002546柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相A：0.1%三氟乙酸溶液，B：乙腈[8]。梯度洗脫條件為：0～15 min B(20%～40%)，15～20 min B(40%～60% )，20～25 min B(60%～100%)。檢測波長：270 nm，進樣量：20 μL，流速：0.8 ml·min-1。

(3)檢測樣品溶液的準備。將定容后的荷葉堿樣品在1 000 r·min-1，10 min條件下離心，取離心后上清液用2 mL的無菌注射器經0.22 μm微孔濾膜過濾，取過膜后的濾液作為液相檢測溶液。

(4)流動相的準備。將三氟乙酸(色譜純)按0.1%的比例加入到經0.45 μm微孔濾膜過膜后的超純水中，乙腈和0.1%三氟乙酸溶液使用前需超聲30 min。

2 結果與分析

2.1 荷葉堿提取結果

本實驗提取的總生物堿經TLC檢測有與荷葉堿標準品Rf值相同的點，均為0.6，證明用酸調節溶液的pH值有利于荷葉堿的提取。

2.2 不同純化方法對荷葉堿分離純化效果的影響

采用陽離子交換樹脂、大孔吸附樹脂以及硅膠柱層析法分別對荷葉堿進行純化，經TLC檢測后可知,雖然3中方法對荷葉堿都有一定的分離純化作用，但對比之下硅膠柱層折法分離純化效果最佳。

2.3 紫外吸收光譜的檢測圖譜與分析

荷葉堿標準品和樣品的紫外吸收圖譜如圖2-3。

根據圖2荷葉堿標準品的紫外吸收圖譜可以看出，荷葉堿在270 nm處的吸光度值最大，而提取的樣品經過紫外全波長掃描可以確定在270 nm處也有吸收，且峰型較為相似，由此可說明提取液中含有純度較高的荷葉堿。

圖2 荷葉堿標準品紫外譜圖

圖3 荷葉堿樣品紫外譜圖

由圖2荷葉堿標準品的紫外吸收圖譜可以看出，荷葉堿在270 nm處的吸光度值最大，而提取的樣品經過紫外全波長掃描可以確定在270 nm處也有吸收，且峰型較為相似，由此可初步證明提取液中可能含有純度較高的荷葉堿。

2.4 紅外吸收光譜的檢測圖譜與分析

荷葉堿標準品和樣品的紅外吸收光譜圖如圖4-5。

圖4 荷葉堿標準品紅外譜圖(KBr壓片)

圖5 荷葉堿樣品紅外譜圖(KBr壓片)

而由圖4和圖5的紅外譜圖可知，實驗所得荷葉堿樣品與標準品譜圖的特征峰基本相符，主要特征峰的位置及峰型變化不大。

2.5 高效液相色譜的檢測結果與分析

經多次檢測確定荷葉堿在270 nm處有最大吸收峰，因此HPLC分析所選用的波長為270 nm，HPLC分析結果如圖6-8。

圖6 荷葉堿標準品液相譜圖

圖7 荷葉粗提液液相譜圖

圖8 荷葉堿樣品液相譜圖

如圖6荷葉堿標準品的HPLC檢測譜圖所示，荷葉堿的保留時間為14.646 min。如圖8所示的荷葉堿樣品的HPLC檢測譜圖，荷葉堿的保留時間為14.736 min，與標準品基本一致。從高效液相色譜圖可以看出，本實驗購買的標準品含有一定量的雜質，也反應出純化荷葉堿是個世界難題。本實驗后續實驗的荷葉堿標準品也需要在另外的公司重新購買，以便于實驗能夠順利進行。

2.6 荷葉堿標準品的線性回歸方程

本實驗共配制了0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1以及0.10 mg·mL-1五個濃度，制作線性回歸方程以液相譜圖峰面積作為縱坐標(Y)，以荷葉堿標準品濃度作為橫坐標(X)，結果見表1和圖9，得線性回歸方程y = 40 979x+6.993 9，R2=0.996 1 。由標準曲線表明，荷葉堿標準品溶液在 0.02～0.10 mg·mL-1的濃度范圍內有較好的線性關系。

表1 荷葉堿標準品濃度與峰面積 /mAU

圖9 荷葉堿標準曲線

荷葉堿樣品的HPLC數據如下：

保留時間為14.736 min，峰面積為2 514.962 2，代入線性回歸方程可得自制荷葉堿樣品含量為0.061 2 mg·mL-1。

(1)

(2)

3 結 論

以荷葉為原料，研究了提取方法、提取溶劑的種類、濃度、pH、提取溫度等對荷葉堿提取率的影響。用在冷凝回流前加入稀鹽酸調節溶液pH至2.0的方法對荷葉堿進行提取，采用強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂對荷葉堿進行了初步分離純化，樹脂洗脫液為3%氨水、40%無水乙醇和57%的水，洗脫速度為5 ml·min-1，然后采用硅膠柱層析的方法對荷葉堿再次進行分離純化，所用硅膠為100-200目，流動相為二氯甲烷：甲醇=30∶1-20∶1。并用TLC法、紫外光譜法、紅外光譜法以及高效液相色譜法對實驗結果進行了檢測。結果表明，pH為2.0的50%乙醇水浴回流法適于荷葉堿的提取，陽離子交換樹脂和硅膠柱層析組合技術可分離純化得到純度為94.15%的荷葉堿，得率3.196%。