花生土壤酚酸降解菌的分離和鑒定

張春楊 于春雨 高金山

摘要 [目的]探尋植物化感自毒化合物降解菌，更好地防治作物連作障礙。[方法]利用化感物質香草酸為唯一碳源，通過平板分離技術和液體培養高效液相色譜技術從花生土壤中分離篩選出1株降解香草酸的目的菌株V-5。對V-5進行底物降解范圍的檢測，并對其進行形態、生化特征和16S rRNA 基因分子系統學研究。[結果]V-5菌株可以降解多種酚酸，其降解率分別為香草酸99.93%、對羥基苯甲酸99.85%、肉桂酸17.44%、丁香酸90.04%、苯甲酸98.69%、阿魏酸38.89%;該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，水解精氨酸，同化葡萄糖、甘露糖、葡萄糖酸鹽、癸酸、蘋果酸、檸檬酸和苯乙酸，細胞色素氧化酶陽性，與惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）非常相似。16S rRNA 基因系統發育分析表明V-5菌株與惡臭假單胞菌親緣關系最近，序列相似度高達99%以上，因此鑒定所分離的酚酸降解菌V-5為惡臭假單胞菌。[結論]該研究為深入開發應用植物化感物質降解菌，促進農業可持續發展提供了理論依據。

關鍵詞 花生;連作障礙;酚酸;降解菌

中圖分類號 X172 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）05-0093-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.025

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective]To explore the degradation bacteria of plant allelochemicals and autotoxic compounds and better control crop continuous cropping obstacles. [Method]Using the allelochemical vanillic acid as the sole carbon source， a strain V5 which degraded vanillic acid was isolated and screened from peanut soil by plate separation technique and liquid culture high performance liquid chromatography.The degradation range of V5 was detected， and its morphology， biochemical characteristics and molecular phylogenetic analysis of 16S rRNA gene were studied.[Result]V5 strain could degrade various phenolic acids， the degradation rate of vanillic acid 99.93%， phydroxybenzoic acid 99.85%， cinnamic acid 17.44%， Syringate 90.04%， benzoic acid 98.69%， ferulic acid 38.89% respectively;the strain was a short rod shaped Gramnegative bacterium， which could reduce nitrate to nitrite， hydrolyze arginine， assimilate glucose， mannose， gluconate， citric acid， malic acid， citric acid and phenylacetic acid， cytochrome oxidase Positive， very similar to Pseudomonas putida.The phylogenetic analysis of 16S rRNA gene showed that the V5 strain had the closest relationship with Pseudomonas putida， and the sequence similarity was over 99%. Therefore， the isolated phenolic acid degrading bacteria V5 was identified as a strain of Pseudomonas putida.[Conclusion]This study provides a theoretical basis for the further development and application of plant allelochemical degrading bacteria and the promotion of sustainable agricultural development.

Key words Peanut;Continuous cropping obstacle;Phenolic acids;Degrading bacterium

花生（Arachis hypogaea L.）是世界上重要的油料作物，2016年我國總產量1 700萬 t，占世界總產量的40%。作為我國第一大油料作物，近年來花生播種面積穩定在466.67 萬hm2左右，其中連作花生所占面積逐漸增加，產生越來越嚴重的連作障礙（continuous cropping obstacle）[1-3]——在同一塊地上連續兩茬以上種植同種或同科作物，即使采用正常的栽培管理措施也會發生作物產量降低、品質變劣和生育狀況差等現象，影響了花生產業的可持續發展。

花生連作障礙的原因機理復雜，概括而言主要跟土壤理化性質惡化、植物化感物質自毒作用、土壤微生物區系失衡等因素有關[4]。連作花生的化感物質種類較多，包括酚酸類、脂肪酸類、醇類、醛類及酮類等[5]。連作積累的酚酸具有較強的自毒作用，李培棟等[6]通過高效液相色譜法測定了單作花生田土壤中的對羥基苯甲酸、香草酸、香豆酸等酚酸，發現它們隨花生連作年限的增加而增加，連作10年后3種酚酸總量達 11.09 mg/kg，顯著高于連作3年和6年的土壤。對羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸等酚酸類物質對花生幼苗的株高、根長和根系活力都表現出抑制作用，并且抑制程度隨酚酸處理濃度的增加而增強[6]。此外，酚酸還可增加花生的發病率，可能是因為酚酸物質破壞花生細胞膜的完整性而使病原菌入侵，影響花生生長，產生連作障礙[6-7]。Patterson等[8]研究了10-3 mol/L濃度下的10 種有機酸對大豆生長的生理與光合效應，結果表明咖啡酸等6種有機酸明顯抑制大豆生長[8]。杜英君等[9]從大豆根系分泌物和植物水浸液中分離出了酚酸物質香草酸、香草醛和對羥基苯甲酸，這類物質與大豆連作障礙有直接關系。

不少學者研究發現，隨著連作年限增加，花生根際及非根際土壤中的細菌和放線菌數量明顯減少，真菌數量明顯增加，土壤微生物從細菌型向真菌型轉化，尤其是病原性真菌類群，如尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、黑曲霉（Aspergillus niger）等[10-12]。其他油料作物如大豆也存在連作障礙菌群失衡的情況。

鑒于上述原因，尋找開發能降解花生自毒化感物質酚酸的菌株資源，不僅有望減輕花生土壤酸化、改善土壤理化條件，減少酚酸對花生生長發育的抑制作用，而且還能直接或間接抑制病原真菌的生長繁殖，改善花生根際微生態環境，從而緩解和防治花生連作障礙。為此，筆者分離降解酚酸的細菌資源并進行分類鑒定，以期為開發菌株資源制備連作障礙生防菌劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品和培養基

土壤樣品來自山東省榮成市一多年種植花生的農田土。香草酸無機鹽液體培養基：香草酸 0.5 g，KNO3 0.2 g，Na2HPO4 5 g，KH2PO4 3 g，NaCl 0.5 g，CaCl2 0.003 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，蒸餾水 1 000 mL，121 ℃條件下滅菌 20 min。香草酸無機鹽固體培養基：香草酸無機鹽液體培養基中加入20 g/L的瓊脂。

1.2 香草酸降解菌的分離篩選

稱取5 g土壤樣品加入45 mL無菌水中振蕩混勻，并進行 10 倍系列稀釋，分別制成 10-1、10-2、10-3、10-4 濃度的菌懸液。各濃度菌懸液分別取100 μL，加到香草酸無機鹽固體培養基平板上涂布均勻，每個濃度設3次重復。將平板放置于 37 ℃恒溫培養箱中培養，每天觀察菌的生長狀況，待長出清晰可見的菌落后通過平板劃線法分離純化，從而分離篩選出以香草酸為唯一碳源和能源生長的菌株。將分離篩選的目的菌株單菌落轉接入香草酸無機鹽液體培養基，在 37 ℃下150 r/min 振蕩培養5 d，以不接菌的空白培養基作對照，用高效液相色譜法（high performance liquid chromtography，HPLC）檢測香草酸含量，從而篩選出可以降解香草酸的目的菌株備用。HPLC檢測采用Waters 高效液相色譜儀，色譜柱采用 C18反相色譜柱，檢測器采用 Waters 2996 Photodiode Array Detecter，以1%甲酸/甲醇（40∶60）為流動相;流速 1.0 mL/min，檢測波長290 nm[13]。

1.3 香草酸降解菌的底物降解譜

將篩選的香草酸降解菌分別取培養液 3 mL接入 30 mL 分別以香草酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、丁香酸、苯甲酸、阿魏酸作底物的無機鹽液體培養基中，底物濃度均為0.5 g/L。分別取零時樣品和 37 ℃下150 r/min 振蕩培養5 d的末時樣品，過濾后用HPLC檢測底物量，從而計算底物降解效率=[（零時底物量-末時底物量）/零時底物量]×100%，得到酚酸降解菌的底物降解譜。

1.4 降解菌的形態及生化特征鑒定

在香草酸無機鹽固體培養基平板上觀察菌落形態;從單菌落上挑菌至滴加蒸餾水的載玻片上制備菌株涂片，經革蘭氏染色后進行光學顯微鏡觀察，明確菌體的形態。選擇API細菌鑒定試劑盒，根據產品使用說明書進行菌株的生化反應試驗并按時觀察結果。

1.5 降解菌的分子系統學鑒定

1.5.1

菌株16S rRNA基因的PCR擴增和測序。將分離篩選的降解菌單菌落接種營養肉湯培養基，37 ℃下200 r/min振蕩培養過夜，吸取1 mL菌液離心收集菌體，用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。以基因組DNA為模板，用針對細菌16S rRNA基因的引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）與1541R（5′ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[14]通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增目的菌株的16S rRNA基因，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測1.5 kb左右的PCR產物，獲得的PCR產物送鉑尚生物技術（上海）有限公司測序。

1.5.2

16S rRNA基因的分子系統學分析。將測得的基因序列通過NCBI網站的 BLAST軟件與 GenBank 數據庫中的序列進行比對，選取不同相似度的代表菌株下載其16S rRNA基因序列，用ClustalX 2.1軟件進行序列比對分析，然后應用 MEGA7 軟件通過Maximum Likelihood方法構建相關菌株16S rRNA基因的系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 降解菌的分離篩選

利用香草酸無機鹽固體培養基分離篩選到能以香草酸為唯一碳源和能源生長的菌株V-5。該菌株菌落較小，邊緣光滑整齊，表面隆起，有光澤，呈乳白色（圖1），V-5菌株轉接香草酸無機鹽液體培養基培養5 d后經HPLC檢測可以降解香草酸。

2.2 菌株的酚酸底物降解譜

將V-5菌株的香草酸液體培養物分別接種香草酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、丁香酸、苯甲酸和阿魏酸作唯一碳源的液體培養基，37 ℃振蕩培養5 d，通過HPLC檢測分析，結果表明菌株V-5不僅可以高效降解香草酸（降解率達99.93%），對其他幾種測試的酚酸化合物也具有不同程度的降解作用（圖2）。其降解率分別為對羥基苯甲酸99.85%、肉桂酸17.44%、丁香酸90.04%、苯甲酸98.69%、阿魏酸 38.89%。由此可見，V-5菌株的酚酸降解譜較寬，其降解香草酸、對羥基苯甲酸、苯甲酸、丁香酸的能力都較強。

2.3 降解菌的形態及生化特征鑒定

對菌株V-5進行革蘭氏染色后鏡檢發現，該菌為革蘭氏陰性短桿菌。進一步用 API 20 NE 非腸道革蘭氏陰性桿菌試劑盒對其進行生化鑒定，結果表明，菌株V-5能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能水解精氨酸，可以同化葡萄糖、甘露糖、葡萄糖酸鹽、癸酸、蘋果酸、檸檬酸和苯乙酸，細胞色素氧化酶陽性。菌株V-5的吲哚反應呈陰性，不能酸化葡萄糖，不能水解尿素、七葉靈、明膠、對硝基-β-D-甲基半乳糖，不能同化阿拉伯糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖、己二酸。根據API 20NE試劑盒使用說明和V-5菌株的生化反應譜在線查詢鑒定結果，發現該菌株可能為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），鑒定指數為 93.4%。

2.4 菌株的分子系統學鑒定

提取V-5菌株的基因組DNA后，利用27F和1541R引物進行PCR反應，結果擴增出約1.5 kb的PCR產物，將產物寄送至上海鉑尚生物有限公司進行測序，獲得了一段1 440 bp的DNA序列，該序列已提交GenBank（accession number MN314837）。

將V-5菌株的DNA序列與GenBank數據庫中的序列進行比對分析，結果發現V-5菌株與假單胞菌屬（Pseudomonas）多個成員的16S rRNA基因具有高度相似性，進一步下載相關菌株的16S rRNA基因序列，通過ClustalX 2.1比對分析后用 MEGA7 構建分子系統發育樹（圖3）。

假單胞菌屬是變形菌門γ-變形菌綱假單胞菌目假單胞菌科的一個屬，包含眾多的種[15]。從以上系統發育樹（圖3）可以看出，分離得到的香草酸降解菌V-5與假單胞菌屬的與惡臭假單胞菌種（Pseudomonas putida）的親緣關系最近，在系統發育樹上緊密地聚集于同一進化支，序列相似度高達99%以上，因此推斷V-5菌株為1株惡臭假單胞菌。

該研究還表明，V-5菌株的16S rRNA基因分子系統學分析結果與API 20NE 試劑盒鑒定結果一致，進而印證所獲得的V-5菌株是1株惡臭假單胞菌。

3 討論

隨著農業生產規?；?、集約化的發展，農作物連作障礙問題日益突出。容易發生連作障礙的農作物不僅限于花生、大豆等豆科作物，還發生于茄科作物如番茄、辣椒、茄子，十字花科作物如白菜、甘藍，葫蘆科作物如甜瓜、西瓜、黃瓜[16]，薔薇科作物如蘋果、草莓等[17]。在這些連作障礙植物中，根分泌物介導著土壤微生物種群組成和多樣性[18-19]，而土壤微生物在調節土壤肥力、改善土壤環境方面發揮重要作用并密切影響植物的生長發育和健康。

為篩選高效化感物質降解菌，錢娜等[20]以花生根系分泌物中的化感物質苯甲酸作唯一碳源，從連作花生長期定位試驗地的健康花生植株根際土壤中篩選出2株高效花生化感物質降解菌，經鑒定分別為木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans HJ-2）和硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducens HJ-3），2株菌都能降解苯乙酮、硬脂酸、棕櫚酸、乳酸、3，5-二甲基苯甲醛和丙三醇等化感物質，為菌株的資源開發奠定了良好的基礎。

Chen等[12]通過16S rRNA 基因克隆文庫技術研究了連作花生土壤的細菌種群演替，認為交替單胞菌目、伯克霍爾德氏菌目、黃桿菌目、假單胞菌目、 根瘤菌目和紅螺菌目等有益微生物種群的簡化是連作條件下花生產量下降的重要因素。該研究以香草酸作唯一碳源首次從花生土壤中分離篩選到香草酸降解菌——惡臭假單胞菌V-5，屬于假單胞菌目，如果進一步開發應用，對恢復連作花生土壤的有益菌群具有重要意義。

自毒化合物[21]。韓麗梅等[22]從番茄的根系分泌物中分離出了香草酸、對羥基苯甲酸、龍膽酸等化感物質。張璐等[23]研究表明，連作甜瓜土壤中對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸的含量隨著連作年限的增加而增加，連作3年后7種酚酸的總量顯著高于未連作土壤。該研究分離到的V-5菌株可以降解香草酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、苯甲酸等酚酸化合物，因而對防治酚酸化合物介導的多種植物連作障礙都具有較大開發價值。

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