PCL生物反應器中催化合成乙酸正戊酯

任德忠，叢方地,,通信作者，王曉紅，張蒙，王鑫鑫，張樹林，羅巍

（1.天津農學院 基礎科學學院，天津 300384；2.天津市水產生態與養殖重點實驗室，天津 300384）

乙酸正戊酯是一種具有香蕉氣味的無色透明液體，是重要的香料和專用有機溶劑，廣泛應用于食品、醫藥、涂料、印染等領域，在國內外有廣闊的需求市場[1]?，F有的酯合成工藝中，使用的催化劑多為雜多酸、負載雜多酸、固體超強酸及無機化合物[2]，且多在高溫、強酸或微波條件下催化反應，難以避免高能耗、酸堿腐蝕、重污染等問題[3]。為克服這些不足，人們正探索生物催化合成方法，如酶催化，具有反應條件溫和、綠色、高效、低碳、高選擇性等諸多優點[4-5]。但酶制劑價格通常較貴，使用成本高。然而，酶固定化后不但催化反應轉化率有很大提高[6]，而且也可提高酶的穩定性[7]。此外，使用固定化酶催化反應產物的分離和純化更便利[8]。在前期研究的基礎上[9-15]，本研究將假單胞菌脂肪酶Pseudomonas cepacialipase（PCL）固定在脫脂棉纖維上，并與反應裝置一起制成生物反應器，催化正戊醇與乙酸乙烯酯發生轉酯反應合成乙酸正戊酯，取得較好的催化效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：恒溫搖床（HZQ-X）、氣相色譜儀（Echrom A90）、電子天平（FA2104A）、移液槍（200 μL、1 000 μL）、恒溫水浴鍋（HH-3）。試劑：假單胞菌脂肪酶（PCL，33 U/mg）酶粉購于Sigma Co., Ltd.公司，正戊醇、乙酸乙烯酯、無水乙醇、正己烷和其他有機溶劑皆為分析純。醫用脫脂棉購于市場，參考相關研究[10]，取10 g脫脂棉置于燒杯中，加入無水乙醇直至完全浸沒脫脂棉，用保鮮膜封口，室溫下浸泡2 d。用鑷子將脫脂棉取出放入干凈的燒杯中，再次加入無水乙醇浸泡1 d。然后用鑷子將脫脂棉取出放入干凈的燒杯中，用多層紗布將燒杯口封好，室溫下自然晾干，使用時用鑷子將其拉至蓬松。

1.2 PCL在脫脂棉上的固定化

參考參考文獻[9]，稱取10 mg PCL酶粉，放入容積為10 mL的柱形玻璃瓶中，加入0.2 mL蒸餾水，輕輕搖晃使酶粉溶于水。稱取10 mg處理過的脫脂棉，加入玻璃瓶中，讓脫脂棉充分吸附酶溶液。然后將玻璃瓶敞口置于搖床中，在37 ℃、160 r/min條件下保持7 h以上[10]，用鑷子將瓶內脫脂棉拉至蓬松狀態，得固定化酶脫脂棉-PCL，連同柱形瓶一起形成脫脂棉-PCL瓶型反應器，見圖1（a）。

圖1 脫脂棉-PCL瓶型（a）和管式（b）反應器

稱取10 mg PCL酶粉放在表面皿中心，加0.2 mL蒸餾水充分溶解酶粉，稱取10 mg處理過的脫脂棉放置于培養皿上，使其充分吸附酶溶液，然后將表面皿放置在恒溫箱中，在37 ℃條件下保持90 min以上，揮發掉水分，用鑷子將脫脂棉撕拉至蓬松，得脫脂棉-PCL，可放入10 mL的柱形玻璃瓶或滴定管中使用。

1.3 酶催化合成乙酸正戊酯反應

分別在含有脫脂棉-PCL和PCL酶粉的10 mL柱形玻璃瓶中加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋上瓶蓋并用保鮮膜密封，在37 ℃、160 r/min條件下催化反應。每個反應體系中的PCL酶粉質量都是10 mg。另外，按照上述方法配制同樣的兩個反應體系，置于37 ℃恒溫水浴鍋中靜置反應。以上所有的反應體系每2 h進行取樣分析。

另在 6個脫脂棉-PCL反應器中，分別加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，靜置在不同溫度下，催化反應24 h，取樣分析。在6個脫脂棉-PCL反應器中，分別加入1 mL正戊醇和2-7 mL的乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，靜置在 37 ℃條件下催化反應 24 h，取樣分析。在 6個脫脂棉-PCL反應器中，分別加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，再分別加入1-6 mL體積不等的正己烷，蓋蓋并密封，靜置在37 ℃下催化反應24 h，取樣分析。

1.4 脫脂棉-PCL瓶型反應器重復催化反應

在1個脫脂棉-PCL反應器中，加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，靜置在37 ℃下催化反應24 h，取樣分析。然后，將反應液傾出，并用少量正己烷清洗3次，敞口放置15 min，使正己烷揮發完全。重新向此反應器中加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，靜置在37 ℃下催化反應24 h，取樣分析。如此循環操作6次。

1.5 不同種脫脂棉-PCL催化合成乙酸正戊酯

在脫脂棉-PCL瓶型反應器中，加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，恒溫37 ℃水浴靜置催化反應，并按時取樣分析。另在10 mL柱形玻璃瓶中，加入在表面皿中固定而得的脫脂棉-PCL（脫脂棉10 mg），如上加入相應量的反應液，并在同樣條件下催化反應后取樣分析。

1.6 脫脂棉-PCL管式反應器中催化反應

將表面皿中固定而得的脫脂棉-PCL（脫脂棉50 mg）撕拉蓬松，裝入酸式滴定管中構成脫脂棉-PCL管式反應器，見圖1（b），將正戊醇與乙酸乙烯酯按體積比1∶2混合均勻后加入到酸式滴定管中，待脫脂棉與溶液充分接觸后開始計時，1 h后，打開滴定管閥門，將與棉花接觸的反應液放出，關閉閥門，對流出液取樣分析。此后，逐漸延長催化反應時間，并放出反應液，取樣分析。

1.7 樣品色譜分析方法

每次分析，取20 μL反應液，用1 mL正己烷稀釋，0.25 μm濾膜過濾，進行GC分析，色譜條件為：氮氣（0.4 MPa，分流比 1∶1），65 ℃，保留3 min；15 ℃/min，130 ℃，保留1.5 min。進樣和檢測溫度分別為280和300 ℃。正戊醇和乙酸正戊酯的保留時間分別為2.6、4.6 min。根據正戊醇和乙酸正戊酯的峰面積計算底物的摩爾轉化率[15]。

2 結果與分析

2.1 搖動和靜置條件下的酶促反應

將脫脂棉-PCL瓶型反應器中的脫脂棉撕成蓬松，可盡可能增大其比表面積[11]，進行催化反應時，反應液與酶的接觸面得以增大，以提高酶催化反應的效率。在37 ℃、分別靜置和搖動條件下，脫脂棉-PCL與PCL酶粉催化正戊醇和乙酸乙烯酯反應生成乙酸正戊酯。由圖2可見，相對于PCL酶粉，脫脂棉-PCL轉化底物的能力明顯較高，2 h后，脫脂棉-PCL催化轉化底物的能力約為PCL酶粉的3倍。搖動和靜置條件相比較，無論酶粉還是固定化酶，在兩種條件下的轉化能力相近，這可能是由于脫脂棉-PCL固定化酶有較大比表面積的原因。因此，可以選在靜置條件下進行酶催化反應，以達到更低碳的效果。

圖2 37 ℃下的酶促反應動力學

2.2 溫度對脫脂棉-PCL催化效果的影響

酶的本質是蛋白質，溫度對酶的構象有較大影響，以致影響其催化作用[16]。在靜置和不同溫度下，脫脂棉-PCL瓶型反應器催化正戊醇和乙酸乙烯酯反應24 h的效果見圖3。室溫（25 ℃）下，反應體系的轉化率即可達 97%?？梢?，此反應器可在靜置和常溫下有效催化反應，達到更低碳催化的效果。

圖3 脫脂棉-PCL瓶型反應器中反應轉化率

2.3 反應底物比和溶劑用量對脫脂棉-PCL催化效果的影響

在酶促反應中，當某一底物濃度固定，反應受底物摩爾比的影響十分顯著[17]。在6個脫脂棉-PCL反應器中分別加入 2-7 mL乙酸乙烯酯，在37 ℃、靜置條件下，催化反應24 h，得到如圖4所示結果。加入不同量的乙酸乙烯酯，酯轉化率出現較小的波動，波動幅度不超過1%，都在99%以上?；诖?，在正戊醇用量為1 mL時，乙酸乙烯酯的用量取最小體積，即2 mL。

圖4 ?；噭┖腿軇γ复俜磻D化率的影響

醇類物質有一定的粘稠性[18]，在反應中有可能影響反應器的酶促轉酯能力。在 6個脫脂棉-PCL瓶型反應器中，加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，再分別加入1-6 mL的正己烷。在37 ℃、靜置條件下，反應24 h，結果如圖4?？梢?，加入正己烷的量對轉化效率的影響并不大，轉化率幾乎接近100%，原因可能是正戊醇在2 mL乙酸乙酯中可以充分地被分散，其粘稠度已經不再對轉化率產生較大影響，無需再向反應體系中加入小分子溶劑進行稀釋。

2.4 脫脂棉-PCL瓶型反應器活性的穩定性

固定化酶催化活性的穩定性對于其應用于催化反應非常重要[19]，為驗證脫脂棉-PCL催化活性的穩定性，脂棉-PCL被重復使用于6次催化反應，每次催化24 h，結果見圖5（a）。參考文獻相關研究[20]，以第一次催化反應后的轉化率作為固定化酶在非水相條件下的初始活力，即 99.4%。以第六次催化反應后的轉化率作為衰減后的酶活力，也就是再重復利用5次后的酶活力，即77.4%。那么，脫脂棉-PCL的反應活力衰減率為（99.4%-77.4%）÷（24 h×5）＝0.18%/h。相對于類似的催化反應[21]，此脫脂棉-PCL催化活性的穩定性不夠理想，但比PCL酶粉的催化效果好[10]。盡管如此，重復利用5次的脫脂棉-PCL可通過重復固定化操作而活化，活化后其催化反應24 h后，轉化率達90.0%，見圖5（b）。雖然其催化反應的轉化率沒有達到初始 99.4%，但相對于衰減后的轉化率77.4%，提高了12.6%?？梢?，脫脂棉-PCL可多次重復利用，其活力衰減后，可通過加水重新固定再次提高酶催化活性。

圖5 脫脂棉-PCL瓶型反應器重復催化反應的轉化率（a）及使用6次后的GC譜圖（b）

2.5 不同種脫脂棉-PCL的催化效果比較

脫脂棉-PCL可以在柱形瓶中也可以在表面皿中固定制備。兩種脫脂棉-PCL在柱形瓶中，在相同條件下催化反應的動力學如圖6所示。由圖可見，在玻璃瓶中固定得到的脫脂棉-PCL（脫脂棉10 mg）催化效率較高，在反應2 h時，其催化反應的轉化率是表面皿中固定所得脫脂棉-PCL（脫脂棉10 mg）催化反應轉化率的2.2倍，盡管如此，后者的活性相對于酶粉還是較高的（圖2）。這可能是因為后者在從表面皿轉移到玻璃瓶的過程中，酶會有部分損失，通過稱量估算，其平均損失率約 9.3%。雖然，表面皿中固定所得脫脂棉-PCL的催化效率相對于柱形玻璃瓶中固定所得脫脂棉-PCL較低，但在反應時間達到24 h后，其轉化率也達到了77.0%（圖6）。此外，在柱形玻璃瓶中制備脫脂棉固定PCL，水分揮發慢，在37 ℃、160 r/min條件下固定10 mg的PCL需7 h，而在表面皿上制備脫脂棉-PCL，僅需1.5 h，大大縮短了固定化操作的時間。

圖6 兩種脫脂棉-PCL酶促動力學（37 ℃、0 r/min）

2.6 脫脂棉-PCL在滴定管中催化反應

將表面皿中固定的脫脂棉-PCL裝入酸式滴定管中，盡可能保持脫脂棉蓬松，并加入反應液，催化反應，如圖1（b）。通過對流出反應液分析發現，反應產率隨時間的延長而增大，室溫下反應5 h，產率達到73.6%，繼續延長反應時間產率增加變?。▓D7）。這可能是因為，在這種反應器中，上部反應液與下部接觸脫脂棉-PCL的反應液間沒有隔離，導致上下反應液間通過分子運動而混合，使試驗測定結果偏低。在今后的試驗中，將進一步改進這種脫脂棉-PCL管式反應器，提高酶促轉化率，以達到室溫和靜置條件下間歇式制備乙酸正戊酯的效果。

圖7 脫脂棉-PCL管式反應器中酶促反應動力學

3 結論

在本試驗中，以脫脂棉纖維為固定化載體材料，通過物理吸附，將PCL酶固定在脫脂棉上，與反應裝置一起構成簡易的生物反應器，用于催化正戊醇和乙酸乙烯酯反應合成乙酸正戊酯，達到了較好的催化效果。在脫脂棉-PCL瓶型反應器中，25 ℃、靜置條件下，反應24 h，轉化率可達97%。相較于傳統催化方法的強酸強堿、高溫等催化條件，脫脂棉-PCL催化反應具有操作簡單，且低碳、高效的特點。在脫脂棉-PCL管式反應器中，常溫靜置的條件下，經5 h的催化，也達到了較好的催化效果，有望將來改造成間歇式生產重要酯類化合物的綠色、低碳生產設備。