上海地區草莓枯萎病病菌的鑒定及對4類殺菌劑的敏感性

許媛 成瑋 顏偉中 肖婷 王建華 吉沐祥 楊敬輝

摘要：為闡明上海地區草莓枯萎病病原菌分類地位及對藥劑的敏感性。運用真菌形態學和分子生物學分類方法，對上海地區不同草莓種植區分離得到的34株病原菌進行鑒定，并采用菌絲生長速率法測定了病原菌群體對4種不同作用機制殺菌劑的敏感性。結果表明，34株病原菌均鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），病原菌群體對多菌靈、咪鮮胺、戊唑醇和吡唑醚菌酯的抑制中濃度（EC50）范圍分別為0.302 7～0.556 2、0.001 1～0.148 2、0.036 1～0.299 7、0.036 8～1.721 6 mg/L。病原菌群體對多菌靈和戊唑醇的EC50比值分別為1.8、8.3，而對咪鮮胺和吡唑醚菌酯的EC50比值分別達134.7、46.8。上海市域范圍內不同地區間的尖孢鐮刀菌對同種殺菌劑的敏感性之間無顯著性差異，對4類不同作用機制殺菌劑之間的敏感性也無顯著相關性（P>0.05）。本研究結果明確了上海地區草莓枯萎病病原菌的分類地位，可以為合理選用殺菌劑防治病害及病原菌抗藥監測提供參考。

關鍵詞：草莓枯萎病病菌;病原菌鑒定;多菌靈;戊唑醇;咪鮮胺;吡唑醚菌酯;敏感性

中圖分類號： S436.68+ 4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0115-06

收稿日期：2018-12-26

基金項目：江蘇省第五期“333”工程培養基金（編號：BRA2017149）;上海市農業委員會示范推廣計劃[編號：滬農推字（2015）第2-7號];江蘇省農業工程[編號：SXGC（2017）214]。

作者簡介：許?媛（1991—），女，江蘇興化人，碩士，助理研究員，主要從事植病生防和化保方面的研究。Tel：（0511）80978081;E-mail：xyyuan007@163.com。

通信作者：楊敬輝，博士，研究員，主要從事農作物病害防控方面的研究。Tel：（0511）80978081;E-mail：yjhnn32@126.com。

上海地區草莓種植面積約為2 000 hm2，主要分布在嘉定、青浦、金山和浦東等地區。近幾年，在上海地區部分大棚草莓移栽初期土傳病害危害嚴重，尤其以枯（黃）萎病為盛。發病植株地上部分新生心葉呈黃綠色、不對稱，呈大小葉狀，地下根呈黑褐色，嚴重時整株枯死，對大棚草莓的產量和品質造成了極大的影響。由于該病田間危害癥狀與黃萎病極其相似，僅從田間表現形態上難以準確區分。因此，本研究對從上海地區草莓主產區顯枯（黃）癥草莓植株上分離得到病原菌群體進行鑒定，并檢測病原菌群體對4種不同作用機制殺菌劑的敏感性，旨在為探明上海地區草莓枯萎病病原菌群體的分類地位，明確病原菌群體對不同作用機制殺菌劑的敏感性現狀，以及為科學防控和抗藥性監測提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試培養基

馬鈴薯瓊脂培養基（potato dextrose agar，簡稱PDA），用于病原菌的分離、保存、鑒定和藥劑敏感性測定。

1.2?菌株采集與分離

于2016年9月草莓移栽初期，從上海市嘉定區、青浦區和金山區大棚草莓園內采集初發病癥的新鮮草莓根部組織，洗凈并用乙醇表面消毒后，采用常規的組織分離方法[1]，每個大棚分離3～5株，經單孢純化后共得到34株菌株，將各菌株編號并保存于PDA斜面上，置4 ℃冰箱保存備用。

1.3?供試藥劑

97.09%多菌靈原藥，由上海升聯化工有限公司提供;95.2%咪鮮胺，由江蘇輝豐農化股份有限公司提供;95%戊唑醇，由江蘇鹽城利民農化有限公司提供;95%吡唑醚菌酯，由德國巴斯夫股份（中國）有限公司提供。多菌靈用0.1 mol/L鹽酸溶解，其余原藥均用丙酮溶解，各藥劑均配制成10 000 mg/L的母液。99%水楊肟酸（salicylhydroxamic acid，簡稱SHAM），購自Sigma-Aldrich公司，用甲醇配制成20 000 mg/L 的母液。所有母液均置于4 ℃保存備用。

1.4?病原菌形態觀察

將經單孢分離得到的菌株移置于PDA培養基上，置于25 ℃黑暗條件下培養，并觀察其菌落形態、顏色、質地等特征。

1.5?病原菌的致病性測定

1.5.1?病原菌分生孢子液的制備

沿病原菌（25 ℃、PDA上培養5 d）邊緣打取直徑為4 mm的菌餅，每個菌株分別挑取4塊菌餅置于裝有80 mL 馬鈴薯液體培養液的體積為250 mL的三角瓶中，每個病原菌接種1個三角瓶，置于25 ℃、120 r/min 條件下振蕩培養5 d，培養液經雙層無菌紗布過濾后，于顯微鏡下用血球計數板計數，并用無菌水稀釋菌液分生孢子濃度至1×105～3×105個/mL，每個病原菌保留100 mL稀釋好的孢子懸浮液，置于4 ℃冰箱備用。

1.5.2?病原菌的接種方法

取紅頰草莓幼苗，洗凈根部，將苗浸于上述（“1.5.1”節）孢子液中30 s 后移栽于裝有滅菌基質與田土混合（體積比為2 ∶8）的草莓苗缽中，每個菌株接種3株草莓苗，以無菌水浸根草莓苗作對照，苗缽置于草莓大棚內培養，21 d后調查發病情況。取樣接種發病的草莓根部組織，參照柯赫氏法則進行病原菌的再分離。

1.6?rDNA-ITS基因部分序列的測定

1.6.1?基因組DNA的提取

在PDA平板上新鮮生長的分離菌邊緣處打取直徑為4 mm的菌塊，接種于置有滅菌玻璃紙的PDA平板上，25 ℃暗培養72 h。將玻璃紙上的新鮮菌絲刮下置于1.5 mL離心管中，于65 ℃烘箱中烘干，用鑷子搗碎備用。真菌基因組的提取參照OMEGA真菌基因組提取試劑盒說明書進行。

1.6.2?PCR擴增及生物信息學分析

rDNA-ITS引物采用真菌rDNA-ITS序列的通用引物[2]：ITS1/ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），預期擴增長度為570 bp。PCR反應程序：95 ℃預變性4 min;94 ℃變性 40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共進行40個循環;最后72 ℃延伸10 min;取5 μL擴增產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行純化和測序。將所得序列用BLAST搜索軟件在NCBI數據庫中進行同源性搜索比對分析。

1.7?草莓枯萎病病菌對4種殺菌劑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法[3]，將保留的供試菌種移植到PDA平板中，25 ℃活化96 h，然后在菌落邊緣用打孔器制取直徑為4 mm的菌塊，移到含系列梯度藥劑濃度PDA平板正中央。多菌靈系列濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mg/L;咪鮮胺系列濃度為0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.160、0.320 mg/L;戊唑醇系列濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mg/L;吡唑醚菌酯系列濃度為：0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000 mg/L，吡唑醚菌酯測定時所有平板中都含100 mg/L SHAM。采用無菌水作對照，每個處理重復3次。25 ℃培養72 h后用十字交叉法測量各處理的菌落直徑（cm），計算各處理的菌落直徑平均值，并按照下列公式計算菌絲生長平均抑制率：菌絲生長平均抑制率=[（對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）/（對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑）]×100%。利用DPS軟件，通過濃度對數值（x）與抑制率概率值（y）之間的線性回歸關系，求出毒力回歸方程和有效抑制中濃度（EC50）。

2?結果與分析

2.1?病害癥狀及病原菌培養性狀觀察

發病草莓植株地上部分復葉呈黃綠色、卷曲，呈現大小葉狀，葉緣變褐、萎蔫至枯死;地下部分呈黑褐色，維管束變褐。采用組織分離法，從上海市嘉定區、青浦區、金山區的不同草莓大棚的草莓病株根頸內組織上共分離純化得到34株單孢菌株（表1）。分離株在PDA培養基上菌絲形態呈白色、質密、絮狀（圖1）。

2.2?病原菌致病性測定

在人工接種草莓幼苗21 d后，地上部分新生心葉變黃、呈現大小葉，或葉緣變褐出現萎蔫癥狀，病情進一步發展后植株死亡，剖開根頸可見內部變褐，與田間觀察到的癥狀一致。從接種發病的草莓根頸內分離得到的菌株與接種所用菌株的菌落形態相似。由此可見接種所用的菌株是引起草莓枯萎病的病原菌（圖2）。

2.3?rDNA-ITS的PCR擴增及序列測定

菌株rDNA-ITS的PCR擴增產物電泳結果表明，所有菌株的擴增條帶都清晰、明亮，大小均約為570 bp的片段?而且不見明顯的非特異性雜帶，符

合預期的擴增結果。測序和同源性序列進行比對分析結果表明，所有菌株均為尖把鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.4?草莓枯萎病病菌對4種殺菌劑的敏感性檢測

采用菌落生長直徑法測得多菌靈、咪鮮胺、戊唑醇和吡唑醚菌酯對34株草莓枯萎病病菌的EC50值分別為（0.449 4±0.077 7）、（0.025 5±0.031 6）、（0.122 7±0.059 1）、（0.467 5±0.415 9） mg/L。34株草莓枯萎病群體對多菌靈和戊唑醇的敏感性差異較小，最大和最小EC50比值分別為1.8、8.3;而對咪鮮胺和吡唑醚菌酯的敏感性差異較大，最大和最小EC50比值分別為134.7、46.8。

2.5?不同地理來源菌株對4種殺菌劑的敏感性差異

分別比較取自嘉定區、青浦區和金山區的草莓枯萎病菌對供試藥劑的敏感性差異。結果（圖3）表明，對多菌靈的敏感性表現為金山區>青浦區>嘉定區（圖3-A），對咪鮮胺、戊唑醇和吡唑醚菌酯的敏感性均表現為嘉定區>金山區>青浦區;不同地區來源的草莓枯萎病病菌對同種殺菌劑的敏感性之間存在差異，但上述差異均未達顯著水平（P>0.05）。

2.6?草莓枯萎病病菌對4種殺菌劑敏感性的相關性

通過敏感性（EC50）線性回歸分析（圖4）得出，多菌靈與咪鮮胺、多菌靈與戊唑醇、多菌靈與吡唑醚菌酯、咪鮮胺與戊唑醇、咪鮮胺與吡唑醚菌酯及戊唑醇與吡唑醚菌酯的決定系數分別為0.004 6、0.011 4、0.063 1、0.200 9、0.046 8、0.007 6，在P=0.05水平上均不顯著，表明草莓枯萎病病菌對這4種不同作用機制的殺菌劑的敏感性之間均無顯著相關性。

3?結論與討論

植物病原菌的鑒定及對藥劑的室內敏感性測定與篩選工作，是正確指導田間病害防治的前提。本研究首次系統分離了上海市主要草莓產區呈現草莓枯（黃）萎綜合癥樣株的病原菌種群，并采用傳統的形態學和現代分子生物學相結合的方法，對病原菌進行鑒定。鑒定結果表明，所有分離菌株均屬尖孢鐮刀菌，其分類地位為半知菌亞門、瘤座菌科、鐮孢屬、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），該結果與吳祥等的報道[4-7]相一致。

值得與同行探討的是，本研究取樣時間為草莓定植期初期，取樣病株為枯（黃）萎病綜合癥病株，即發病幼苗新生葉失綠變黃或彎曲畸形、復葉上的兩側小葉不對稱呈畸形（典型的大小葉）、葉色黃化的病株?而非萎蔫枯死的枯萎病癥株。組織分離均

用根頸內部的褐色組織，所有分離菌株從菌落培養特征上可以初步判定為鐮孢霉屬（Fusarium spp.），沒有一個菌株的菌落形態類似輪枝孢屬（Verticillium spp.）。類似的，從江蘇省蘇南地區鎮江市、蘇州市和無錫市的顯枯（黃）復合癥病株上，也只分離得鐮孢霉屬致病真菌。為此，從上述病原菌分離鑒定結果似乎可以得出，蘇南和上海地區危害草莓根部顯枯（黃）萎病癥的病原菌，都是鐮孢霉屬真菌，而非輪枝孢屬真菌。

本研究檢測了上海市嘉定區、青浦區和金山區3個草莓主產區的草莓枯萎病病菌群體，對目前生產上常用的苯并咪唑類、咪唑類、甾醇脫甲基抑制劑類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的敏感性。上海地區草莓枯萎病菌種群對多菌靈的EC50均值為0.449 4 mg/L，略小于顧春波等報道的山東省草莓枯萎病病菌對多菌靈的敏感基線EC50均值（0.561 mg/L）[8]，而與陳宏州等報道的江蘇省草莓枯萎病病菌抗多菌靈菌株的EC50均值 （24.278 3 mg/L）[9]，和楊煥青等報道的山東省抗多菌靈的草莓枯萎病病菌菌株的EC50（49.490 0 mg/L）有極顯著性差異[10]。本研究中草莓枯萎病病菌種群間對多菌靈的最大與最小EC50的比值只有1.8（0.302 7～0.556 2 mg/L），且菌株敏感性頻率分布呈連續性單峰曲線，可以把EC50均值（0.449 4 mg/L）作為上海地區草莓枯萎病病種群抗藥性檢測的敏感基線。綜上分析，可以得出上海地區草莓枯萎病菌種群對多菌靈敏感。

裴龍飛等報道112株蔬菜尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）對咪鮮胺的平均EC50為0.030 1 mg/L，并將此值定為抗性檢測的敏感基線[11]。本研究取樣的34個菌株EC50均值（0.025 5 mg/L）小于報道的敏感基線值，但菌株間的最大和最小EC50比值達到134.7（0.001 1～0.148 2 mg/L），且菌株敏感性頻率呈不連續分布，因此種群中可能產生了敏感性下降的亞群體。本研究取樣菌群中只有6株菌株的EC50（0.040 6～0.148 2 mg/L）超過報道值，其余28株菌株中EC50值小于0.01 mg/L（0.0010～0.009 9 mg/L）的有13株菌株，有15株菌株的EC50在0.0100～0.029 8 mg/L之間?；谏鲜鲈?，在上海地區草莓枯萎病病菌對咪鮮胺的敏感基線EC50的確立時，應取去除EC50陡然增高的2株菌株（16cf25和16cf04）后的EC50均值（0.018 8 mg/L）為抗藥性檢測的敏感基線較為適合，還需要從分子水平確定EC50陡然增高的2株菌株是抗性菌株，還是種群間的極端變異株菌株。

上海地區草莓枯萎病病菌取樣種群對戊唑醇的EC50均值為0.122 7 mg/L，低于顧春波等報道的山東省草莓枯萎病菌敏感菌株種群對戊唑醇的EC50（0.213 0、0.357 0、0.470 5 mg/L）[8，10，12]，近似于陳宏州報道江蘇省草莓枯萎病菌對戊唑醇的EC50（0.154 4 mg/L）[9]。本研究中草莓枯萎病病菌種群間對戊唑醇的最大與最小EC50比值為8.3（0.036 1～0.299 7 mg/L），且種群敏感性頻率分布呈連續性單峰曲線，可以把取樣種群EC50均值（0.122 7 mg/L）作為上海地區草莓枯萎病病菌對戊唑醇抗藥性檢測的基線，并指出上海地區草莓枯萎病病菌種群對戊唑醇敏感，沒有出現敏感性下降的亞群體。

文獻檢索表明，國內外有關草莓枯萎病病菌對吡唑醚菌酯敏感基線的研究尚未見報道，本研究中取樣種群對吡唑醚菌酯的EC50均值為0.467 5 mg/L，種群間對吡唑醚菌酯的最大與最小EC50比值為46.78（0.036 8～1.721 6 mg/L）。取樣的34株菌株中有4株菌株的EC50陡增，超過1.0 mg/L。因此，在確定種群對吡唑醚菌酯的敏感性基線時，應取去除EC50陡增的4株菌株后種群的EC50均值為宜，本研究中確定的草莓枯萎病病菌對吡唑醚菌酯的抗藥性檢測基線的EC50為0.334 7mg/L，僅供參考。取樣種群病菌對吡唑醚菌酯的敏感性頻率呈不連續分布，說明上海地區草莓枯萎病對吡唑醚菌酯可能產生了敏感性下降的亞種群。我們還需要從分子水平上確定EC50陡增的4株菌株是抗性菌株，還是極端變異菌株。

草莓枯萎菌是土壤傳播病害，病原菌抗藥性在跨區域間流行傳播的可能性較小。本研究表明，不同地區間枯萎病病菌種群對同一藥劑的敏感性間有天然異質性差異（除試驗操作外）的可能性，但相鄰地區來源的草莓枯萎病病菌對同種殺菌劑的敏感性之間沒有顯著性差異（P>0.05）。因此，有必要研究上海地區草莓枯萎病病菌種群對藥劑的敏感性，便于與其他省份的報道相對比。本研究中確定的上海地區草莓枯萎病病菌種群對多菌靈、咪鮮胺和戊唑醇的敏感基線值都小于其他省份的報道值，說明不能通過直接參考其他省份的數據，來當作上海地區草莓枯萎病病菌種群對藥劑的敏感性基線。

在本研究中，雖然取樣菌株不是未接觸過藥劑的野生菌株，但鑒于上海地區還未有草莓枯萎病病菌種群對苯并咪唑類、咪唑類、甾醇脫甲基抑制劑類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的敏感性研究。因此，可以把本研究中草莓枯萎病病菌種群的平均EC50（有些去除陡增大的值）作為抗藥性檢測的敏感基線。需指出的是，由于任何敏感基線的建立都是各自實驗室特有的，因此，本研究中建立的敏感基線值僅供同行研究時參考。

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