晚期宮頸癌患者HIF-1α、HIF-2α及ERCC-1蛋白檢測的臨床意義

袁小慶 邢益祥 康敏

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，主要包括鱗癌、腺癌和腺鱗癌三種病理類型，晚期多可通過淋巴系統向遠處轉移[1]。雖然近年來持續突破的研究使得宮頸癌的發病率和死亡率都大大下降，但宮頸癌仍然是困擾女性健康的重要疾病，并且近年來，宮頸癌的發病不斷向年輕化發展[2]。因此，進一步研究宮頸癌分子生物學水平的相關發病機制對宮頸癌的臨床治療具有重要意義。由于實體腫瘤的發展過程中普遍存在低氧環境，HIF基因的表達已被證實與諸多腫瘤的發生發展具有相關性[3]。臨床上對于早期宮頸癌患者，主要采用手術治療，而對于中晚期的患者，多采用放療和化療。近年來，臨床上開始采用手術聯合術前新輔助化療對晚期宮頸癌患者進行治療，但是新輔助化療對患者的療效受多種因素的影響[4]。據報道，ERCC-1基因表達分型是影響治療效果的重要因素之一[5]。故本次試驗設計一方面以晚期宮頸癌患者和宮頸良性病變患者進行對照，分析HIF-1α、HIF-2α在宮頸癌的發生發展中的作用和兩者之間的相關性，另一方面根據宮頸癌患者ERCC-1基因的分型的不同，分析ERCC-1基因的表達對于新輔助化療治療效果的影響，以期為臨床評估宮頸癌患者病情和選擇治療方法提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年8月至2016年2月收治的晚期宮頸癌患者30例(其中，ERCC-1基因表達為C/C型和T/T型的各15例)，納入標準：(1)組織病理學明確診斷為宮頸癌，根據國際科婦科聯盟分期標準分期為Ⅲ-Ⅳ期[6]；(2)尚未接受手術、化療或放療；(3)外周血ERCC-1基因表達為C/C型或T/T型；(4)患者年齡>18歲；(5)患者知情本研究內容并簽署知情同意書。排除標準：(1)無新輔助化療指征的患者；(2)合并嚴重的心、腦血管系統疾病以及肝、腎、肺等實質性臟器組織疾病的患者；(3)妊娠期或哺乳期的患者。本研究經醫院倫理學會批準進行。另選取同時我院收治的宮頸良性病變患者30例，將宮頸癌患者作為觀察組，良性病變患者作為對照組。2組患者的年齡、BMI等一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。根據觀察組患者外周血ERCC-1基因表達不同，將觀察組患者分為C組和T組，每組15例，2組患者的年齡、BMI和病理分型等一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 C組和T組患者一般資料情況 n=15

1.2 方法

1.2.1 HIF-1α、HIF-2α基因表達的檢測：采用RT-PCR法，引物由長豐生物科技有限公司提供，標本保存環境為-80℃，碾磨時也在冰上進行，先提取總的RNA并檢測濃度，再轉換成cDNA反應體系，在37℃條件下孵育60 min。孵育完成后完成40個PCR循環，染料采用SYBR Green熒光染料，根據收集到的熒光信號來分析結果。

1.2.2 HIF-1α、HIF-2α蛋白的檢測：采用免疫組化法，試劑盒購于北京中杉金橋公司，按照說明書對標本進行切片、固定，并經一抗和二抗孵育后，用二氨基聯苯胺顯色2 min，蘇木精復染30 s，脫水后封片。陽性表達為棕黃色顆粒。

1.2.3 新輔助化療：2組患者服用醋酸地塞米松片(廣東華南藥業集團有限公司，規格：0.75 mg/片)1片，每6小時1次，連服2次。在用化療藥物前30 min 給予鹽酸苯海拉明注射液(河南天方藥業股份有限公司，規格1 ml∶20 mg)1支進行預處理，化療藥物用量為：紫杉醇注射液(上海新亞藥業有限公司，規格5 ml∶30 mg)150 mg/m2，順鉑注射液(云南個舊生物藥業有限公司，規格6 ml∶30 mg)75 mg/m2。1個化療周期為21 d，共化療6個周期。

1.3 觀察指標 (1)2組患者的HIF-1α、HIF-2α基因在病理組織中的表達；(2)2組患者的HIF-1α、HIF-2α蛋白的表達；(3)不同ERCC-1基因型患者化療療效及預后情況比較；(4)HIF-1α、HIF-2α以及ERCC-1蛋白與患者貧血、化療后中位PFS和中位TTP的相關性分析。

1.4 評價指標

1.4.1 HIF-1α、HIF-2αmRNA：測量觀察組和對照組HIF-1α、HIF-2αmRNA的表達量。

1.4.2 HIF-1α、HIF-2α蛋白表達計分：由富有經驗的病理科醫師制定積分表準：陽性細胞百分比：以1%、10%、50%、80%為分界點，個各區間分別記0、1、2、3、4分；著色強度：弱中強分別記1、2、3分。兩項分值相加作為最終計分。1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為陽性，6～7分為強陽性。陽性率=(弱陽性+陽性+強陽性)/總例數×100%。

1.4.3 療效標準：近期療效分為：①完全緩解：病灶消失且無新病灶出現，維持>4周；②部分緩解病灶最大直徑之和減少≥30%，維持>4周；③穩定：病灶最大直徑之和減少<30%或增大<20%；④進展：病灶最大直徑之和增大≥20%，或者出現新的病灶?？傆行?(完全緩解例數+部分緩解例數)/30×100%。

2 結果

2.1 2組患者組織中HIF-1α、HIF-2α基因的表達 觀察組HIF-1αmRNA、HIF-2αmRNA的表達量分別為(9.12±0.64)、(8.98±0.77)，對照組為(7.13±0.33)、(7.02±0.15)。差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 2組患者HIF-1α、HIF-2α蛋白表達 觀察組患者HIF-1α、HIF-2α蛋白表達陽性率(63.33%、70.00%)均明顯高于對照組(16.67%、13.33%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2、3。

表2 2組患者HIF-1α蛋白表達比較 n=30，例(%)

表3 2組患者HIF-2α蛋白表達比較 n=30，例(%)

2.3 不同ERCC-1基因型患者化療效果及預后比較 C組和T組的近期療效總有效率分別為80.00%、33.33%，差異有統計學意義(P<0.05)；C組的中位生存期、中位進展時間以及2年生存率均顯著高于T組(P<0.05)；2組患者在治療期間，各項不良反應的發生率差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同ERCC-1基因型患者化療療效及預后情況比較 n=15

2.4 HIF-1α、HIF-2α以及ERCC-1蛋白與患者貧血、化療后中位PFS和中位TTP的相關性分析 以HIF-1α、HIF-2α以及ERCC-1蛋白表達水平作為自變量分別與患者貧血、化療后中位PFS和中位TTP進行Spearman或Pearson相關性分析，結果顯示：HIF-1α、HIF-2α與患者是否存在貧血有明顯相關性(P<0.05)，而ERCC-1分型與患者的化療后中位PFS和中位TTP具有明顯相關性(P<0.05)。見表5。

3 討論

目前，醫學科研工作中，對于腫瘤的靶向治療的研究是一項熱門領域。要實現腫瘤的靶向治療，需要我們不斷提高對腫瘤組織在分子水平的特征的了解。實體腫瘤在其生長發育的過程中，由于普遍存在低氧環境，故容易誘導HIF-1、HIF-2基因的表達[7]。HIF-1、HIF-2能夠通過參與調節細胞增殖、新血管生成和腫瘤干細胞分化等途徑實現對腫瘤生長發育的干預[8]。

表5 HIF-1α、HIF-2α以及ERCC-1蛋白與患者貧血、化療后中位PFS和中位TTP的相關性分析

HIF-1最早在低氧環境中誘導激活EPO轉錄而發現，是一種氧依賴性轉錄因子，在缺氧條件下其表達加強，可廣泛存在于各個組織細胞中[9]。HIF-1由α和β兩種亞基構成，其中，HIF-1α是HIF-1所獨有的氧調節蛋白[10]。在缺氧條件下，HIF-1α的降解受阻，可與HIF-1β穩定結合，表達水平提高[11]。另外研究表明，除缺氧外，HIF-1α表達水平的提高還可能與抑癌基因的失活、某些金屬離子、某些生長因子和細胞因子等有關[12]。目前已經明確的HIF-1基因的靶基因有70幾種，包括離子代謝、能量代謝、兒茶酚胺代謝、腫瘤轉移和腫瘤血管生產、炎性反應、細胞增殖等方面，可編碼的產物包括EPO、VEGF、IGF-1、ET-1、血紅素加氧酶-1等，這些物質在腫瘤組織中，可以參與細胞代謝、血管生成、腫瘤的浸潤轉移等多項活動[13，14]。因此，HIF-1基因在腫瘤的發生發展中起著非常重要的作用。HIF-2α也是腫瘤分子水平的研究熱門之一，主要探究其在腫瘤的生長及預后中的作用，據報道，HIF-2α存在于多種腫瘤組織中，且相較于HIF-1α的表達更具組織特異性[15，16]。

宮頸癌的治療同樣是臨床研究的熱門領域，一些分子水平的檢測指標同樣可以反映患者對治療效果的敏感度，據報道，ERCC基因表達與順鉑新輔助化療的療效有密切關系[17]。順鉑新輔助化療是目前臨床上廣泛采用的一種術前輔助化療方式，鉑類藥物主要通過與細胞DNA形成穩定加和物，從而導致DNA的損傷，組織腫瘤細胞的增殖[18]。腫瘤組織對鉑類藥物的敏感性受多種因素的影響，其中，DNA損傷的耐受程度是最重要的因素之一，而核苷酸切除修復作為人類最主要的DNA修復方式，與DNA損傷的耐受程度最為相關[19]。ERCC-1基因則是參與該修復方式的最主要基因，它在識別基因受損部位后，可與其他蛋白協同切開受損DNA的5’端，從而參與核苷酸的切除修復。此外，ERCC-1基因還可以通過雙鏈斷裂、同源末端鏈接等其他途徑參與DNA的修復[20]。據報道，不同基因型的ERCC-1基因有不同的表達頻次和程度，且C/C型相較于T/T型對鉑類藥物的反應更好[21]。還有研究報道，ERCC-1基因型為T/T型，可顯著提高多種惡性腫瘤的發生風險[22]。

本研究結果顯示，晚期宮頸癌患者的HIF-1α和HIF-2α基因以及蛋白的表達，相較于良性病變的患者均具有特異性，證明HIF-1α和HIF-2α基因在腫瘤的生長發育過程中，可能通過某種方式起著促癌的作用，并且，HIF-1α、HIF-2α蛋白的表達還與患者是否存在貧血具有相關性。另有研究報道，HIF-1α的表達還可能與患者是否存在淋巴結轉移相關[23]。因此，HIF-1α、HIF-2α的表達可以考慮作為臨床上宮頸癌和宮頸臉型病變的篩查指標之一。治療方面，ERCC-1基因型為C/C型的患者接受順鉑新輔助化療的近期療效、中位進展期、中位生存期、以及2年生存率都明顯優于T/T型患者。說明C/C型患者的ERCC-1基因表達程度更低，DNA修復能力更弱，對順鉑新輔助化療具有更高的敏感性，在實際臨床工作中，可將ERCC-1基因分型作為選擇治療方法的重要參考因素。

綜上所述，臨床上對于疑似宮頸癌的患者，測量HIF-1α和HIF-2α基因和蛋白的表達情況，有助于協助診斷。而對于已經確診為晚期宮頸癌，需要進行化療的患者，測量ERCC-1基因型有助于選擇有效的化療方案，具有重要的臨床意義。