大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠淋巴細胞功能的影響

鄒蕾 黃志遠 楊橋 金紅旭

作為一種常見的外科急腹癥，重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)的主要病理特征為胰腺彌漫性出血和組織壞死，并伴有全身性免疫功能紊亂，其發病急驟、病情兇險、進展快、預后差、病死率高[1,2]。關于其發病機制目前尚不完全清楚，但有觀點認為胰腺消化酶的激活導致胰腺自身發生消化，期間胰腺細胞和間質出現水腫，使全身炎性反應瀑布系統被激活，最終引發全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory respone syndrome,SIRS)以及多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)而導致機體死亡[3,4]。免疫過激引發的全身炎性反應綜合征和多器官功能障礙綜合征所致的早期死亡，以及免疫抑制引起感染加重所致的疾病后期死亡是該病死亡的兩個高峰[5]。作為中草藥大黃的有效成分，大黃素(Emodin，EMO，1,3,8-三羥基-6-甲基-9,10-蒽醌)是一種廣泛存在于大黃、蘆薈、虎杖等蓼科藥用植物中的羥基蒽醌類化合物。近年來大黃素被證實對重癥急性胰腺炎有較好的治療效果[6]。然而，關于其對淋巴細胞影響的報道筆者所見仍不多見，因此，本研究以重癥急性胰腺炎大鼠為實驗模型，探討大黃素對淋巴細胞功能的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器 45只SPF 級健康雄性SD大鼠，采購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號SCXK(京)2012-0001，體重200～240 g，于北京維通利華實驗動物技術有限公司采購，于60%～65%濕度、20～24℃室溫，日光燈每天照射12 h以維持晝夜循環，適應性飼養1周，期間讓其自由飲水飲食。?；悄懰徕c和大黃素均于美國Sigma公司采購；CD3FITC、CD8PE、CD45Percp、CD4APC、CD16+56PE、CD19APC抗體、PE熒光直標大鼠Foxp3 檢測試劑盒、大鼠 Bregs 流式試劑盒均購自美國eBscience公司；大鼠淋巴細胞分離液購自天津灝洋；白介素10(IL-10)、轉化生長因子β1(TGF-β1)檢測試劑盒購自Abcam。OLYMPUS BX50型光學顯微鏡；Eppendorf Centrifuge 5430R/5417R型離心機；流式細胞儀；Biosystems 7500 Fast Real-Time PGR System型PCR儀。

1.2 重癥急性胰腺炎大鼠模型的建立 術前不限制飲水，但禁食12 h，稱重后腹腔注射10%水合氯醛溶液以麻醉大鼠，之后將大鼠固定于手術臺，腹部剪毛并常規消毒，鋪巾，于上腹劍突下作切口進入腹腔，使十二指腸和胰膽管暴露，將胰膽管遠端膽管近肝門處用無損傷血管夾雙重夾住，于十二指腸乳頭附近將0.45 mm 頭皮針經十二指腸外壁穿入腸腔，逆行插入胰膽管末端并用血管夾將枕頭固定。用微量泵以 0.1 ml/min的速度將新鮮配置的5%牛黃膽酸鈉溶液(1 ml/kg)推注至主胰管內，完成后觀察5 min，待周圍組織出現棕紅色改變即可拔出頭皮針，無損傷血管夾繼續夾閉 5 min以使各胰腺小葉內充分進入?；悄懰徕c溶液，取下血管夾，將十二指腸復位并確認腹腔無活動性出血，關腹縫合。假手術組除不泵入?；悄懰徕c外其他操作均相同。

1.3 實驗動物分組及給藥 45只SD大鼠隨機分為3組，假手術組、SAP模型組和EMO治療組，每組15只。給藥方式：EMO治療組建模后1 h腹腔注射大黃素；假手術組和SAP模型組腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.4 HE染色觀察胰腺組織病理學變化 取大鼠胰腺組織置于液氮中冷凍后用冰凍切片機切片，固定，60℃蘇木精染色，流水沖洗，加1%鹽酸乙醇，促藍液返藍，0.5%曙紅液染色，依次經梯度乙醇脫水及二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.6 流式細胞儀分析全血中Bregs細胞含量 治療后24 h采集各組大鼠新鮮全血并各取0.5 ml，分別加適量1×紅細胞裂解液置于室溫下靜置20 min，離心棄上清，加5%BSA混勻后4℃作用1 h，加細胞染色液清洗，離心棄上清，加大鼠Bregs流式試劑盒抗體，避光孵育40 min，之后細胞染色液清洗，離心棄上清，置于流式細胞儀上進行檢測。

1.7 ELISA檢測IL-10、TGF-β1 采集小鼠全血，分離血清，采用ELISA試劑盒檢測IL-10、轉化生長因子β1 (TGF-β1)水平，具體操作參照試劑盒說明書進行。

1.8 RT-qPCR檢測淋巴細胞中Foxp3、CTLA-4的mRNA 取適量分離的淋巴細胞，用Trizol提取細胞中總RNA并進行反轉錄獲取cDNA，以該cDNA為模板進行熒光定量PCR反應，檢測組織中Foxp3、CTLA-4的表達水平。同時以β-actin作為內參基因。每個樣本均進行3次重復實驗。

2 結果

2.1 3組大鼠胰腺組織病理學變化 假手術組大鼠胰腺組織未見出血，白細胞浸潤、壞死及破裂，小葉僅出現輕度水腫。SAP模型組可見腺泡完整性被破壞，腺泡細胞出血、水腫、壞死以及炎性細胞浸潤，腺泡液外溢，胰腺小葉間隙增寬。EMO治療組大鼠胰腺組織病理變化較SAP模型組顯著改善，向假手術組發展。見圖1。

假手術組SAP模型組EMO治療組

圖1 3組大鼠胰腺組織病理學變化(HE染色×200)

2.2 3組T淋巴細胞亞群(CD4+和CD8+)百分比 與假手術組相比，SAP模型組大鼠全血中CD4+細胞亞群百分比、CD4+/CD8+比值均降低，CD8+細胞亞群百分比升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與SAP模型組相比，EMO治療組CD4+細胞亞群百分比、CD4+/CD8+比值顯著升高，CD8+細胞亞群百分比顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組T淋巴細胞亞群(CD4+和CD8+)百分比

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAP模型組比較，#P<0.05

2.3 3組調節性T細胞(Tregs)和調節性B細胞(Bregs)含量 SAP模型組大鼠Tregs細胞比例較假手術組升高，差異有統計學意義(P<0.05)；EMO治療組Tregs細胞比例較SAP模型組降低，差異有統計學意義(P<0.05)。SAP模型組大鼠Bregs細胞比例較假手術組顯著降低(P<0.05)；EMO治療組Bregs細胞比例較SAP模型組升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組Tregs和Bregs含量

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAP模型組比較，#P<0.05

2.4 3組IL-10和TGF-β1水平 與假手術組相比，SAP模型組大鼠血清中IL-10和TGF-β1水平顯著降低(P<0.05)；EMO治療組IL-10和TGF-β1水平高于SAP模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.5 3組淋巴細胞中Foxp3 、CTLA-4的mRNA 表達 SAP模型組Foxp3 mRNA及CTLA-4 mRNA水平顯著高于假手術組(P<0.05)；與SAP模型組相比，EMO治療組Foxp3 mRNA及CTLA-4 mRNA水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 3組大鼠血清中IL-10和TGF-β1水平

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAP模型組比較，#P<0.05

表4 各組淋巴細胞中Foxp3、CTLA-4的mRNA 相對表達量

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAP模型組比較，#P<0.05

3 討論

全身性免疫功能紊亂是重癥急性胰腺炎的伴發癥狀，病程早期常因免疫過激引發全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合癥，后期則因免疫抑制加重感染，最終都導致了死亡的發生。以往研究證實大黃素具有抑菌抗炎、清除氧自由基和抗氧化、保護肝腎、利膽利尿、免疫調節等藥理作用[7]。在重癥急性胰腺炎中，大黃素可降低血清及胰腺組織中的白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha-α，TNF-α)等炎性因子水平，抑制胰酶釋放，保護腸黏膜，減輕對腎和心肌的損傷[8]。

本研究經膽胰管逆行推注?；悄懰徕c建立重癥急性胰腺炎大鼠模型，同時給予腹腔注射大黃素，HE染色發現SAP模型組大鼠胰腺組織出現明顯病理變化，EMO治療組病理變化顯著改善，表明SAP大鼠模型建立成功，且證實大黃素對大鼠重癥急性胰腺炎有治療作用，可減輕胰腺組織的病理損傷。在機體炎性反應中，淋巴細胞不僅能通過促進免疫反應來清除病原微生物，還發揮免疫調節的功能，對過強的免疫應答具有抑制作用。作為淋巴細胞的主要組分之一，T細胞介導體液免疫，在成熟的T細胞表面均有CD3分子表達，但CD4、CD8卻不同時表達，因此成熟的T細胞可被分為CD4+T細胞和CD8+T細胞兩個亞群，兩者的含量及比值常用來反映機體的免疫功能[9,10]。本研究發現SAP模型組大鼠CD4+T細胞含量及CD4+/CD8+比值均下降，EMO治療組則顯著升高，提示SAP模型組大鼠免疫功能受到抑制，EMO可提高機體免疫功能，從而減輕病理癥狀。

調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)在微生物感染、過敏反應、移植耐受及腫瘤免疫中均發揮重要作用。免疫抑制性和免疫無能性是Treg細胞的兩大特性，其免疫抑制性的主要表現為，經TCR介導的信號刺激激活的Treg對CD4+和CD8+T淋巴細胞的活化和增殖具有抑制作用，并且無MHC限制性，同種同型或同種異型T細胞的增殖均可被抑制[11]；其免疫無能性的主要表現為，IL-2特異性抗原和抗原提呈細胞(APC)的刺激使Treg處于低反應狀態，但IL-2高濃度時Treg在TCR刺激下則發生活化并增殖[12]。有效控制病原體T細胞反應之間的平衡以及調節導致嚴重炎癥和組織破壞的過度T細胞反應是Treg最主要的功能。Treg過多或過少均引起免疫平衡失調，病情加重，因此Treg對機體免疫平衡具有重要作用[13]。文獻報道，Treg細胞功能增強或數量增加均可使炎性反應減輕，然而對病原體的控制能力也降低。Foxp3m RNA及其編碼的蛋白質于Treg上特異性表達，且介導Treg的表型、發育、活性及功能，Foxp3穩定且持續性高表達是Treg發揮正常功能活性的必備條件，因此Foxp3被作為Treg的特征性標志[14]。Treg免疫抑制性主要是通過分泌抑制性細胞因子及細胞接觸等方式非特異性抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞的增殖活化。膜表面分子CTLA-4能為T淋巴細胞的活化提供第二信號，以阻斷其協同刺激通路，因而發揮介導Treg細胞接觸抑制的作用[15]。淋巴細胞凋亡是目前公認的導致膿毒癥免疫功能紊亂的主要原因，尤其是CD4+T淋巴細胞過度凋亡引起的免疫抑制[16]。本研究發現SAP模型組大鼠Tregs細胞比例較假手術組升高，EMO治療組Tregs細胞比例較SAP模型組降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。SAP模型大鼠的Treg比例增加提示其功能活性強且對機體具有免疫抑制性，可能是CD4+T淋巴細胞凋亡增加使其比例升高；EMO使 Treg比例降低，分析原因可能是EMO促進了Treg凋亡或抑制了其他T淋巴細胞凋亡。Foxp3和CTLA-4變化與Treg一致，進一步證實Treg在SAP大鼠中具有免疫抑制作用，而EMO則可減輕這種免疫抑制，對SAP起到治療作用。

調節性B細胞(regulatory B cell，Bregs)通過分泌抑制性抗體或抑制性細胞因子調節其他免疫細胞的功能，抑制過度炎性反應，參與機體免疫應答的調節，在免疫功能紊亂、自身免疫病及移植排斥等狀態下亦發揮重要作用[17]。研究證實Bregs是分泌IL-10和TGF-β1的主要細胞，且其調節作用與兩種細胞因子密切相關[18]。小鼠體外實驗發現Bregs降低腫瘤壞死因子等細胞因子的表達是通過分泌IL-10以使細胞表面MHCⅡ類分子的表達減少。Bregs在炎癥環境及細胞因子下被激活后才會大量分化并發揮生物學效應，Bregs活化后可上調Tregs表面抗原以使Tregs發生改變，T細胞介導的炎癥進而轉化為自限性炎癥，最終導致自身免疫被抑制[19]。Bregs通過增加Tregs上Foxp3和CTLA-4的表達且依靠細胞間直接接觸進而誘導Tregs的產生[20]。本研究中，SAP模型大鼠Bregs細胞比例較假手術組顯著降低(P<0.05)；EMO治療組較SAP模型組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。IL-10和TGF-β1分泌水平與Bregs細胞比例變化一致。推測可能是重癥急性胰腺炎引起機體免疫功能嚴重紊亂，Bregs的激活受到抑制，含量降低，分泌及釋放的IL-10和TGF-β1少，以致于無法及時糾正過度炎癥反應，導致大量炎性因子的釋放進一步對多器官造成損傷；EMO可能是通過促進Bregs的激活，加大了IL-10和TGF-β1的分泌及釋放，進而抑制炎性反應，利于機體恢復。

綜上所述，大黃素對重癥急性胰腺炎具有治療作用，可能是通過提高CD4+T細胞含量及CD4+/CD8+比值使機體免疫功能增強，或者通過降低Treg比例減輕機體免疫抑制狀態，以及增加Bregs比例促進IL-10和TGF-β1的分泌及釋放進而抑制炎性反應。