河北省重癥肺炎患兒非細菌性呼吸道病原學研究

趙夢川 吳勇 黃迎彬 王樂 郭巍巍 楊碩 嚴小桐 李貴霞 馮志山

肺炎是兒童尤其是嬰幼兒常見的呼吸道感染性疾病，在全世界范圍內有很高的發病率和病死率。據WHO資料顯示，肺炎目前仍然是全球5歲以下兒童死亡的首要原因[1]，全球每年有數百萬兒童死于肺炎[2,3]。兒童肺炎易反復遷延,治療不得當會引發重癥肺炎[4]。重癥肺炎是肺炎同時存在其他臟器的功能紊亂、衰竭以及并發癥狀的兒科危重癥疾病，具有發病迅速、病情嚴重等臨床特點，病死率為20%～30%，是發展中國家5歲以下兒童死亡的重要原因之一[5]。細菌、病毒及肺炎支原體是兒童肺炎的常見病原體，既往多認為細菌是導致重癥肺炎的主要病原體之一；而眾多的國內外研究發現流感病毒、呼吸道合胞病毒(HRSV)、腺病毒(HADV)等呼吸道病毒也可導致重癥肺炎[4-7]。故充分了解兒童重癥肺炎的病原體分布情況及流行病學特點，對其臨床診斷、合理用藥及預防控制至關重要。目前，河北省重癥肺炎患兒非細菌性呼吸道病原體感染情況尚不清楚。因此，為進一步了解近年來河北省兒童重癥肺炎的呼吸道病原感染情況，我們分析了2 481例于河北省兒童醫院住院治療的重癥肺炎患兒非細菌性呼吸道病原體的檢出情況，并結合患兒年齡、發病季節，分析本地區兒童重癥肺炎的病原學特征，研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 調查對象 以河北省兒童醫院重癥醫學科2016年1月至2017年12月2 481例診斷為重癥肺炎的患兒為研究對象。其中男1 509例，女972例，男女比例為1.55∶1， 年齡分布為1個月～13歲，其中1～12個月(含12月)1 519例，占61.23%,1～3歲679例，占27.37%，4～6歲173例，占6.97%，≥7歲110例，占4.43%。

1.2 重癥肺炎診斷標準 參照中華醫學會兒科學會呼吸分組重癥肺炎的標準[8]:(1)一般情況差；(2)有拒食或脫水征；(3)有意識障礙；(4)呼吸頻率明顯增快(嬰兒RR>70次/min，年長兒RR>50次/min)；(5)有發紺；(6)有呼吸困難(呻吟、鼻翼扇動、三凹征)；(7)多肺葉或≥2/3的肺受累；(8)有胸腔積液；(9)脈搏血氧飽和度≤0.92；(10)有肺外并發癥。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與儀器:核酸提取試劑盒和13種呼吸道病原體多重檢測試劑盒(PCR毛細電泳片段分析法)購自寧波海爾施基因科技有限公司；全自動核酸提取儀Smart LabAssist-32購自臺灣圓點奈米技術股份有限公司； GenomeLabTM GeXP遺傳分析系統購于美國貝克曼庫爾特有限公司；PCR擴增儀購自美國ABI公司。

1.3.2 標本采集與處理:在患兒入院24 h內使用吸痰器(參照吸痰器的使用說明書進行操作)采集其深部氣道吸取物，加1 ml 0.9%氯化鈉溶液，充分混勻后用于病原體核酸提取。樣本采集和運送過程中應避免污染。

1.3.3 核酸提取:使用“核酸提取試劑”在全自動核酸提取儀Smart LabAssist-32上進行自動核酸提取。

1.3.4 常見非細菌性呼吸道病原體檢測:使用多重RT-PCR方法[9]同時檢測甲型流感病毒(InfA)、甲型流感病毒H1N1(09H1)、季節性H3N2病毒(H3)、乙型流感病毒(InfB)、HADV、博卡病毒(Boca)、鼻病毒(HRV)、副流感病毒(HPIV)、衣原體(Ch)、偏肺病毒(HMPV)、肺炎支原體(Mp)、冠狀病毒(HCOV)和HRSV，具體操作步驟如下：①根據試劑說明書配制PCR擴增體系；②在PCR儀上編輯如下擴增程序并進行擴增：25℃，5 min，1個循環；50℃，15 min，1個循環；95℃，2 min，1個循環；94℃，30 s，65→60℃，30 s，72℃，60 s(65→60°C，1℃降落退火，共6個循環)；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，60 s(29個循環)；72℃，10 min，1個循環；4℃保存至電泳。③選擇“Fragment”電泳方法，在GenomeLabTM GeXP遺傳分析系統上進行PCR產物的毛細電泳分離(詳見GenomeLabTM GeXP遺傳分析系統操作說明)。

1.4 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件，計數資料的分析采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 非細菌性呼吸道病原體檢出情況 在2 481份呼吸道標本中，2 049份非細菌性病原體檢測陽性，檢出率為82.59%。病毒檢出1 944例次，檢出率為78.36%，其中檢出率最高的是HRV，為814例次(32.81%)，其次為HRSV 712例次(28.70%)和HPIV 255例次(10.28%)。非典型病原體共檢出216(8.70%) 例次，其中Mp 170例次(6.85%)，Ch 46 例次(1.85%)。見表1。

2.2 混合感染檢出情況 2 049份病原體檢測陽性的標本中，546份(21.93%)至少有2種或2種以上病原體混合感染，其中483份檢出2種病原體(表1)，59份標本中檢出3種病原體，4份標本中檢出4種病原體(表2)。814份HRV陽性標本有406份(49.88%)檢出其他病原體， HRSV、HPIV、Mp、FluA、HADV、FluB、HCOV、Boca、HMPV和Ch陽性標本中分別有31.04%(221/712)、40.39%(103/255)、48.82%(83/170)、34.73%(58/167)、63.27%(93/147)、32.77%(39/119)、62.96%(51/81)、67.53%(52/77)、32.88%(24/73)和60.87%(28/46)檢出其他病原體。見表2。

2.3 非細菌性呼吸道病原體的季節分布 春季和冬季病原體總檢出率高于夏季和秋季，且冬季混合感染率亦高于夏季和秋季，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 13種常見非細菌性呼吸道病原體的檢出情況(檢出例數) 例

表2 混合感染分布情況

此外，不同呼吸道病毒的季節差異則各有特點：HRSV秋季和冬季檢出率明顯高于其他季節(P<0.05)；Boca在秋季檢出率最高，其次為冬季；HPIV夏季和秋季檢出率較高；HADV春季和夏季檢出率較高；FluA和HMPV春季檢出率明顯增高；HRV在春季檢出率低于其他季節；HCOV冬季檢出率低于其他季節；FluB檢出率極低，但在2016年春季出現了感染高峰。非典型病原體中，Mp秋季檢出率高于其他季節，差異有統計學意義；Ch秋季檢出率亦略高于其他季節，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 非細菌性呼吸道病原體的季節分布情況 例(%)

注：與春季比較，*P<0.05；與夏季比較，#P<0.05；與秋季比較，△P<0.05

2.4 非細菌性呼吸道病原體的年齡分布 1～3歲年齡組患兒的病原體總檢出率和混合感染率最高，其次是1～12個月年齡組、4～6歲年齡組和≥7歲年齡組，差異有統計學意義(P<0.05)。此外，不同病原體在各年齡段的檢出情況不同(除HCOV外)，且差異有統計學意義(P<0.05)：HRV在1～3歲年齡組檢出率最高，其次在1～12個月年齡組也有較高的檢出率；HRSV在1～12個月年齡組的檢出率明顯高于其他3個年齡組(P<0.05)；HPIV在1～12個月年齡組檢出率最高，其次是1～3歲年齡組；InfA和InfB在4～6歲年齡組的檢出率最高；HADV在1～3歲和4～6歲年齡組的檢出率高于1～12個月和≥7歲年齡組；HCOV在1～12個月和1～3歲年齡組檢出率較高；Boca在1～3歲年齡組的檢出率最高，其次是1～12個月年齡組，在4～6歲和≥7歲年齡組未檢出Boca；HMPV在4～6歲年齡組的檢出率最高，其次是1～3歲年齡組； Mp在≥7歲年齡組的檢出率明顯高于其他3個年齡組(P<0.05)，Ch在1～12個月年齡組檢出率最高。見表4。

表4 不同年齡段兒童重癥肺炎非細菌性呼吸道病原體的分布情況 例(%)

注：與1～12月比較，*P<0.05；與1～3歲比較，#P<0.05；與4～6歲比較，△P<0.05

3 討論

病毒、細菌和非典型病原體均可引起兒童重癥肺炎，且存在混合感染[7,10-12]。近幾年，隨著分子診斷學技術的不斷發展與應用，國內外已有較多報道證實病毒是重癥肺炎患兒的主要病因：van de Pol等[7]在入住PICU的急性下呼吸道感染患兒中采用熒光定量PCR檢測病毒，其檢出率高達96%。陳玉等[12]采集重癥肺炎患兒的痰液、咽拭子和靜脈血，分別采用病原菌培養、RT-PCR和間接免疫熒光法檢測細菌、病毒和肺炎支原體，結果提示病原檢測陽性率為86.65%，其中病毒感染最多見，陽性率為37.32%。本研究對2 481例重癥肺炎患兒的下呼吸道分泌物進行了13種常見非細菌性呼吸道病原體的檢測，檢出率為82.59%，提示非細菌性呼吸道病原體是本地區兒童重癥肺炎的重要病原體；其中9種常見呼吸道病毒此次均有檢出，總檢測率為78.36%，高于我國貴陽、重慶等地[13,14]，分析原因可能是本研究采用的檢測方法為敏感性較高的多重RT-PCR，且檢測的病毒種類比較多；病毒中HRV的檢出率最高，其次為HRSV和HPIV，而重慶、貴陽等地的研究未將HRV納入檢測范圍，故這些地區兒童重癥肺炎的主要病毒病原仍是HRSV；此次研究共檢出非典型病原體216(8.70%) 例次，包括肺炎支原體170例次(6.85%)和衣原體 46 例次(1.85%)，檢出率高于重慶地區[15]，但低于貴陽地區[13]。

混合感染是導致兒童肺炎的重要原因之一，而且與單獨細菌或者病毒感染相比，混合感染可導致更嚴重的炎癥反應及臨床表現[10]。本研究中重癥肺炎患兒的混合感染率為29.1%，高于本地區急性下呼吸道感染患兒的混合感染率(23.75%)[16]，說明混合感染可能是重癥肺炎的危險因素之一?；旌细腥局?8.5%為雙重感染，以HRV合并HRSV感染最常見。有報道稱兒童重癥肺炎的混合感染以病毒合并細菌感染多見[13,15]，而本研究中，因不能排除患兒入院前經抗生素治療的可能，未將細菌納入檢測范圍，故推測本地區重癥肺炎患兒的混合感染率遠遠高于29.1%，建議兒科醫生提高對重癥肺炎患兒多病原體檢測的關注。

呼吸道病毒感染多具有明顯的季節性，本研究中，冬春季病原體總檢出率高于夏秋兩季，與以往研究結果[16]一致。而且，不同呼吸道病毒流行具有不同的季節性差異，HRSV、InfA、 InfB、HADV和HCOV OC43/HKU1主要流行季節為冬春季,HCOV 229E/NL63、HMPV主要流行季節為冬季，HRV流行季節為春秋季，HPIV3流行季節為春夏季，Boca流行季節為夏冬季[16-19]。本研究中，HRSV秋冬季檢出率較高，Boca在秋季檢出率最高，HPIV夏秋季檢出率較高，HADV春夏季檢出率較高，FluA、FluB和HMPV春季檢出率明顯增高，HRV在春季檢出率低于其他季節，HCOV冬季檢出率低于其他季節，與王勝娥等[16]的報道存在一定差異，分析本研究對象為重癥肺炎患兒，王勝娥等的報導研究對象為急性下呼吸道感染患兒，而非單純重癥，說明本地區重癥肺炎患兒呼吸道病毒的季節分布規律可能與非重癥肺炎患兒不同。

本研究中，1～12月嬰兒占61.23%，1～3歲幼兒占27.37%，可見兒童重癥肺炎主要發生在嬰幼兒時期。此外，本研究發現1～12月和1～3歲年齡組中，呼吸道病毒的檢出率較高，而4歲及以上患兒中，Mp的檢出率較高，與以往報道[10,16,20,21]一致。以往的研究發現HRV是石家莊地區5歲以上兒童急性下呼吸道感染的首要病毒病原，而本研究中，HRV在1～3歲年齡組檢出率最高，其次是1～12月年齡組，說明HRV是導致本地區嬰幼兒重癥肺炎的重要病原之一。國內不同地區的病原學研究結果顯示 HRSV 是兒童急性下呼吸道感染中最重要的病原體[22]，也是兒童重癥 CAP 的首位病毒病原[13]。本研究中HRSV是1～12月年齡組患兒中檢出率最高的病毒病原，與以往研究結果一致，說明HRSV是導致小嬰兒重癥肺炎的重要病原體。HADV可引起兒童重癥肺炎的暴發流行[23]，可導致嚴重的肺部后遺癥[24]，有一定的病死率(<5%)[25]。本研究中HADV在1～3歲和4～6歲年齡組的檢出率最高，InfA和InfB在4～6歲年齡組的檢出率最高，與北京地區研究結果[26]一致。與國內多數地區報道[13,16,26]一致，本研究中，HPIV、Boca及近年新發現的HCOV在3歲以下嬰幼兒中檢測率最高，是本地區嬰幼兒重癥肺炎的重要病毒病原體。HMPV亦是近年新發現的呼吸道病毒，謝正德等報道北京地區HMPV在1～<3歲組的檢測率最高，王勝娥[16]報道石家莊地區HMPV感染主要集中在 2～4 歲，本研究中HMPV在4～6歲年齡組的檢出率最高，其次是1～3歲年齡組，存在的差異可能與研究地區及研究對象的不同有關。

綜上所述，本研究對本地區兒童重癥肺炎明確病原體結果前的經驗性治療及早期病原體診斷具有重要的指導及參考意義。