肖典冰
(泗涇醫院 上海 201601)
1.1.1 臨床菌株 收集2018年1月—2018年10月期間,從本院患者臨床無菌部位標本中分離的65株念珠菌。
1.1.2 質控菌株 ATCC 90028白色念珠菌、ATCC22019近平滑假絲酵母菌為質控菌珠。
1.2.1 常規鑒定 標本按常規方法培養、分離,沙保羅平板上純培養、經革蘭氏染色鏡檢,轉種假絲酵母菌顯色培養基進行鑒定,顯綠色,翠綠色的是白色念珠菌;藍灰色,鐵藍色的是熱帶念珠菌;粉紅色,模糊有菌毛菌落較大的是克柔念珠菌;紫色的是光滑念珠菌。
1.2.2 儀器鑒定 顯色培養基上為白色菌落或顯色不清楚的念珠菌,取純培養物用法國生物梅里埃YST鑒定卡在VITEKII全自動微生物分析儀上進行鑒定。質控菌株:白假絲酵母菌ATCC90028、近平滑假絲酵母菌ATCC22019。
1.2.3 特異性PCR檢測 所有收集的菌株都用PCR擴增的方法進行最終鑒定。
1.2.3.1 念珠菌基因組DNA提取 玻璃珠振蕩法提取念珠菌屬DNA;(1)準備高壓過的1.5ml EP管;(2)每支EP管內分裝約50μl的玻璃珠;(3)向分裝好玻璃珠的EP管內加入300μl~500μl雙蒸水;(4)編號,使用1μl一次性接種環,從三區挑取分純的大菌落3~4個或小菌落7~8個,在EP管中充分研磨,最終濁度控制在1.0~2.0McF之間,切勿過稀或過濃;(5)將蓋好蓋的EP管在振蕩器上振蕩30s(隱球菌60s);(6)EP管100℃水浴/金屬浴15min;(7)將水浴后的EP管置于-80℃ 1~2min,待蒸汽沉降后13,200轉離心5min;(8)取新EP管編號;(9)從離心后的EP管中小心吸取上清液200~250μl左右移入新EP管中,棄去舊管;(10)將提取的DNA置于4℃進行保存。
1.2.3.2 PCR擴增體系Mix 12.5μL,ITS-1(F)0.1μL,ITS-4(R)0.1μL,DNA2μL,ddH2O,9.3μL。
1.2.3.3 PCR反應條件及電泳檢測 將Eppendorf管放入PCR儀,蓋好管蓋,設定PCR條件。擴增條件為:94℃10min,,94℃30sec,50℃30sec,72℃60sec,72℃10min,30個循環。
1.2.3.4 DNA片段測序及序列對比: 所得序列使用Blastn與CBS真菌多樣性研究中心醫學真菌數據庫中的標準序列(http://www.cbs.knaw.nl/databases)進行比對,并結合菌株形態學特征,即可準確鑒定至屬的水平。
1.2.4 真菌藥敏 真菌藥敏測定按試劑說明書操作,主要步驟有制備菌懸液、接種標本并加樣、礦物油封蓋、35℃培養24~48h,觀察結果。注意設立陰性對照孔和陽性對照孔。
顯色方法結合儀器鑒定的結果顯示在臨床無菌部位標本中分離65株無菌部位念珠菌中,白色念珠菌28株(43.1%),光滑念珠菌15株(23.1%),隱球菌10株(15.4%),近平滑念珠菌5株(7.7%),無名假絲酵母菌3(4.6%),葡萄牙假絲酵母菌2(3.1%),熱帶念珠菌1株(1.5%),克柔念珠菌1株(1.5%),見表1。
表1 65株念珠菌的分類
PCR鑒定的結果顯示在臨床無菌部位標本中分離65株無菌部位念珠菌中白色念珠菌27株(41.5%),光滑念珠菌10株(15.4%),隱球菌10(15.4%),近平滑念珠菌7(10.8%),熱帶念珠菌5株(3.0%),無名假絲酵母菌3(4.6%),葡萄牙假絲酵母菌2(3.1%),克柔念珠菌1株(1.5%),見表2。
表2 65株念珠菌的分類
ATB FUNGUS 3真菌藥敏測定試劑盒(微量稀釋法)法結果顯示在65株念珠菌中,兩性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和氟康唑等四種藥物對白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、隱球菌、近平滑念珠菌、無名假絲酵母菌、葡萄牙假絲酵母菌、表現出較強的敏感性。兩性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶對克柔念珠菌表現出較強的敏感性。氟康唑對光滑念珠菌的敏感性較差,敏感率為84.5%??巳崮钪榫鷮Ψ颠虮憩F出很高的耐藥性,耐藥率為65.5%。伊曲康唑對念珠菌屬的敏感性較差。見表3、4。
表3 65株念珠菌的藥敏結果(%)
表4 65株念珠菌的藥敏結果(%)
引起深部真菌感染的主要有念珠菌、隱球菌、曲霉、毛霉等,其中以念珠菌感染比較常見,主要包括白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌等等。其中以白色念珠菌為最常見的致病菌。當機體發生正常菌群失調或抵抗力下降時,可引起皮膚念珠菌病、粘膜念珠菌病、內臟及中樞神經念珠菌病[1]。在本組資料中,顯色方法結合儀器鑒定的結果顯示在臨床無菌部位標本中分離65株無菌部位念珠菌中,白色念珠菌28株(43.1%),光滑念珠菌15株(23.1%),近平滑念珠菌5(7.7%),無名假絲酵母菌3(4.6%),葡萄牙假絲酵母菌2(3.1%),熱帶念珠菌1株(1.5%),克柔念珠菌1株(1.5%),PCR鑒定的結果顯示在臨床無菌部位標本中分離65株無菌部位念珠菌中白色念珠菌27株(41.5%),光滑念珠菌10株(15.4%),隱球菌10株(15.4%),近平滑念珠菌6(9.2%),熱帶念珠菌5株(3.0%),無名假絲酵母菌3(4.6%),葡萄牙假絲酵母菌2(3.1%),克柔念珠菌1株??梢姛o菌部位的念珠菌感染仍然以白色念珠菌為主,但是白色念珠菌感染所占的比例明顯低于之前68.6% 的報道。
PCR方法結果發現有6株菌株與念珠菌顯色培養基結合儀器鑒定的結果兩者不符,1株菌株顯色結果是白色念珠菌,PCR鑒定結果是熱帶念珠菌。3株菌株顯色結果是光滑念珠菌,PCR鑒定結果是熱帶念珠菌。2株菌株顯色結果是光滑念珠菌,PCR鑒定結果是近平滑念珠菌。這是因為顯色方法對于顏色判斷具有主觀因素,特別是顏色本身就不明顯時,判斷容易出現錯誤。但是PCR是通過特異性的擴增ITS片段并對擴增產物進行檢測,特異性與準確性較高,最終還是以PCR結果可靠。
伏立康唑被證實對念珠菌屬具有良好的活性,其MIC值<0.1125mg/L有試驗發現伏立康唑抗白念珠菌和熱帶念珠菌的活性比氟康唑高8倍[2]。因此,本此實驗在利用ATB FUNGUS 3真菌藥敏測定試劑盒(微量稀釋法)對5-氟胞嘧啶(5-FC)、兩性霉素B(AMB)、氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VRC)進行藥敏分析。本文ATB FUNGUS 3結果顯示兩性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和氟康唑等四種藥物對白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、隱球菌、近平滑念珠菌、無名假絲酵母菌、葡萄牙假絲酵母菌、表現出較強的敏感性。兩性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶對克柔念珠菌表現出較強的敏感性。氟康唑對光滑念珠菌的敏感性較差,敏感率為84.5%??巳崮钪榫鷮Ψ颠虮憩F出很高的耐藥性,耐藥率為65.5%。伊曲康唑對念珠菌屬的敏感性較差。兩性霉素B單獨使用抗真菌活性很強,對深部真菌引起的嚴重的內臟或全身感染的治療效果很明顯。5-氟胞嘧啶抗真菌活性譜較窄,單獨使用容易產生耐藥,據報道5-氟胞嘧啶與兩性霉素B聯合使用, 不易產生耐藥性,已取得了一定療效。因此在臨床工作中針對真菌感染及時進行真菌培養和藥敏試驗,合理使用抗真菌藥物,以提高治愈率,降低病死率。