慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立與評價

張迪，夏藝，范麗，劉士遠，管宇

(海軍軍醫大學附屬長征醫院，上海 200003)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是一種慢性氣道炎性病變，以持續氣流受限為特征。據預測，COPD將在2020年成為全球主要死亡原因第三位及世界疾病經濟負擔第五位[1-3]。COPD主要由吸煙、二手煙暴露、燃料燃燒產生的煙霧、基因因素等導致[4]。COPD呈進行性發展，即使戒煙，病情仍然會進一步惡化,但早期診斷干預可以有效延緩病程。目前缺乏COPD早期診斷及治療的有效手段，為解決這一問題，需要進一步了解COPD病程中的病理生理變化。COPD動物模型可在短期內呈現出疾病特點，有助于揭示早期COPD發生發展過程中的動態變化。因此，越來越多的學者致力于構建穩定的、與人類病理生理變化類似的動物模型。

被用來制作COPD模型的動物有很多種，如豚鼠、小鼠、大鼠、猴、羊、牛、豬等[5]。其中大鼠可在煙熏等誘因下快速構建穩定模型，且呈現出與人類相似的病程，因此被廣泛應用[6-7]。由于吸煙是COPD的主要誘因，在多種COPD動物模型建立方法中，煙熏模型表現出與人類患者最相似的病理生理特征，包括氣道炎癥、肺氣腫、氣道重塑和肺功能受損等。煙熏模型應用廣泛，但造模方法(如實驗中香煙種類、數量、煙熏頻率、總時間等)缺乏統一標準，使研究間的比較相對困難，實驗的可重復性不佳，蛋白酶模型也存在這一不足。不同造模方法的結合同樣需要標準指導實驗，以滿足不同的實驗需求。此外，目前缺乏不同造模方法的對比研究，造模方法的選擇存在困難。

本研究擬采用煙熏、氣管內滴注蛋白酶以及兩者結合的方式分別建立COPD大鼠模型，對比三者的造模效果，以期為COPD的研究提供穩定可靠的建模方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性II級Wistar大鼠140只，體重(190 ± 10)g，周齡6 ～ 7周，由海軍軍醫大學動物中心提供【SCXK(滬)2018-0006】，飼喂設施由中國人民解放軍海軍醫學研究所【SYXK(軍)2017-0041】提供。飼養環境溫度控制在(22 ± 2)℃，正常飼養7 d后進行實驗。隨機分為4組：⑴正常對照組n=20；⑵煙熏組n=60；⑶蛋白酶組n=30；⑷蛋白酶+煙熏組n=30。

1.1.2 試劑與儀器

彈性蛋白酶(南京奧多福尼生物科技有限公司，中國)，香煙(大前門，焦油含量10 mg/根)，1%戊巴比妥鈉(天津蘭洪新能源科技有限公司，CAS：57-33-0)，4%多聚甲醛溶液(武漢楚江浩宇化工科技發展有限公司，CAS：30525-89-4)，0.9%氯化鈉溶液(華潤雙鶴藥業股份有限公司，CAS號：7647-14-5)，無水乙醇(上海處泰化工科技有限公司，CAS號 64-17-5)，純凈水等。

微型計算機D7K67PA(惠普，美國)，SCANCO uCT80 Micro-CT(SCANCO medical AG，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 體重測量

每周測量大鼠的體重，監測各組大鼠體重動態變化規律。

1.2.2 建立模型

煙熏組使用PAB-S200被動吸煙動物染毒系統(煙熏箱大?。?0 cm × 60 cm × 58 cm)及香煙進行造模。煙熏過程中使用試管及抽吸裝置對大鼠進行間歇煙霧暴露，模擬人類吸煙過程中煙霧暴露模式。每次煙熏同時點燃香煙20根，直至完全燃燒且煙霧基本散盡，共持續40 min，每天煙熏2次，兩次間隔時間不少于4 h，一周煙熏6 d。

將蛋白酶組大鼠頸部皮膚及肌肉分離，暴露主氣管，使用注射器向主氣管內滴注彈性蛋白酶一次，劑量為50 IU/100 g。蛋白酶+煙熏組將氣管滴注蛋白酶與煙熏相結合，氣管內滴注彈性蛋白酶(50 IU/100 g)后第二天起，按煙熏組的方法進行煙熏處理。

1.2.3 標本制備

煙熏組于煙熏24 h，1、2、4、8、12、16、20、24周處理大鼠各5只，對照組于對應時間處理大鼠各2只，蛋白酶+煙熏組于煙熏24 h，1、2、4、8、12周處理大鼠各5只，蛋白酶組于相應時間處理大鼠各5只。經氣管向兩側肺內反復緩慢注入并抽回生理鹽水共4.5 mL左右，進行支氣管肺泡灌洗。離體肺標本用4%多聚甲醛溶液固定48 h后進行乙醇梯度脫水獲得干燥肺標本(圖1)。

圖1 脫水后的干燥肺標本Figure 1 Dried lung specimen after dehydration

1.2.4 標本Micro-CT檢查及圖像分析

肺標本行Micro-CT檢查。Micro-CT掃描參數：管電壓70 kV，管電流144 μA，分辨率18 μm。主觀評價CT圖像是否出現肺大泡，肺密度減低，炎癥等COPD表現，并記錄出現時間。

1.2.5 標本病理學檢查及圖像分析

標本經石蠟包埋后，每個肺葉選取3張切片，行HE染色，鏡下觀察標本是否出現肺泡擴張、融合，間隔變窄、斷裂等改變，并記錄出現時間。

肺泡灌洗液1500 r/min離心10 min，留取上清液。采用大鼠白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)及基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9, MMP-9)ELISA 試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)檢測細胞因子IL-10、MMP-9水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件。比較組間體重及細胞因子差異時，若數據分布符合正態分布，采用方差分析；否則采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體重

對4組大鼠進行體重測量，結果如圖2、3所示。與對照組相比，煙熏組大鼠及蛋白酶+煙熏組大鼠體重增長緩慢，第7周起煙熏組、蛋白酶+煙熏組大鼠體重增長值與對照組出現差異(P< 0.05)。蛋白酶組與對照組體重增長無顯著差異，但蛋白酶組大鼠1 ～ 4周體重增長較對照組稍緩慢。

2.2 細胞因子

本研究中蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組大鼠第24 h、1、2、4周IL-10水平顯著低于對照組(P< 0.05，圖4)。蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組第24 h MMP-9濃度顯著大于對照組(P< 0.05)，此后，蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組MMP-9濃度與對照組雖無顯著差異，但較對照組稍高(圖5)。煙熏組及對照組間IL-10及MMP-9未見明顯差異。

2.3 Micro-CT及病理

對照組Micro-CT圖像及病理圖像均未見明顯異常(圖6a)，蛋白酶組、蛋白酶+煙熏組第4周及煙熏組第8周Micro-CT圖像均可見肺大泡，局部肺組織密度減低，部分可見炎癥，肺內病變分布均勻(圖6b1-d1紅色箭頭標注部分)；病理圖像均可見肺泡擴張，間隔變窄，部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合等(圖6b2-d2黑色箭頭標注部分)。四組Micro-CT結果與病理結果一致。

圖2 煙熏組大鼠及對照組大鼠體重變化Figure 2 Weight gain changes in the smoking group and the control group

圖3 蛋白酶組、蛋白酶+煙熏組及對照組大鼠體重變化Figure 3 Weight gain changes in the protease group, the smoking + protease group and the control group

圖4 四組大鼠IL-10水平變化Figure 4 Changes of IL-10 concentrations in the four groups

圖5 四組大鼠MMP-9水平變化Figure 5 Changes of MMP-9 concentrations in the four groups

注：a：正常對照組；b：煙熏組；c：煙熏+蛋白酶組；d：蛋白酶組。紅色箭頭：肺大泡，局部肺組織密度減低，可見炎癥；黑色箭頭：肺泡擴張，間隔變窄，部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合。圖6 四組大鼠Micro-CT及病理表現(HE染色，對照組×200，其他×400)Note. a, Control group. b, Smoking group. c, Smoking+protease group. d, Protease group. Red arrow: pulmonary bullous, reduced density of lung and inflammation. Black arrow: alveolar ectasia, alveolar fusion and alveolar septal destruction.Figure 6 Micro-CT images and photographs of HE-stained lung tissue under optical microscopes (control group, ×200; others, ×400)

3 討論

理想的動物模型需表現出人類疾病的特點，盡可能使模型發病機理與人類疾病同源，此外還需滿足模型制備可重復性高，動物成活率高等條件。目前尚無理想COPD動物模型。嚙齒類動物、猴、羊、狗等均可用于COPD動物模型制備，其中大鼠因基因、行為特征及易進行實驗干預的特點成為建造COPD模型，模擬人類COPD病程的常用動物。

大鼠是否適用于COPD造模仍存在爭議。有研究報道大鼠不易誘發產生COPD[8]，也有研究顯示，僅需2個月的煙熏就可觀測到大鼠的肺氣腫改變[9]。人類對COPD并不易感，需多年的煙熏才會造成COPD。因此，造模時間并非選擇造模動物的決定性因素。

COPD造模方法有很多，如煙熏、蛋白酶或脂多糖氣管滴注、基因水平造模等[10-12]。本研究選擇較常用的煙熏、氣管滴注蛋白酶及兩者相結合的造模方法。煙熏造模效果與香煙類型，煙霧暴露方法及暴露時間有關，但三者均無統一標準[13-14]。Churg等[15]研究表明產生肺氣腫需6個月，而Leberl等[9]只需2個月。本研究采用大前門香煙(焦油含量每根10 mg)及全身暴露的模式對大鼠進行煙熏。蛋白酶—抗蛋白酶失衡學說是COPD發病機制的經典學說，基于此，彈性蛋白酶被廣泛應用于COPD模型制作。本研究采用氣管內滴注彈性蛋白酶(南京奧多福尼生物科技有限公司)的方法進行造模。

有研究表明IL-10分布廣泛，可抑制炎癥反應[16-17]。其在COPD病程中的變化過程及作用目前仍存在爭議。曾華東等[18]對支氣管肺泡灌洗液細胞進行培養，并測定細胞培養上清液中IL-10含量，結果表明COPD組與對照組無明顯差異。有研究[19]認為COPD組與正常對照組間血清IL-10水平亦無顯著差異。但也有研究[20]發現與正常對照組相比，COPD患者血清IL-10水平下降，說明IL-10參與COPD炎癥反應。梁柱等人發現肺泡灌洗液中COPD組IL-10水平明顯高于對照組[21]。本研究對煙熏組及對照組的支氣管肺泡灌洗液IL-10水平進行測定，發現兩組間無顯著差異。而蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組大鼠24 h、1、2、4周IL-10水平顯著低于對照組。這可能因為24 h～4周蛋白酶產生炎癥導致IL-10水平下降，隨后蛋白酶逐漸降解，炎癥消退。因存在檢測誤差或試劑盒靈敏度不夠可能，不能排除煙熏導致炎癥可能。MMP-9為促炎細胞因子，可分解氣道和肺組織的細胞外基質及基底膜，參與氣道和肺組織的重塑過程。Li等[22]分析923名COPD患者及641名健康受檢者細胞因子水平，發現COPD患者血清MMP-9水平顯著高于健康對照組。Aneta等[23]的研究表明 COPD患者痰液中MMP-9水平亦高于健康對照組。本研究中煙熏組與對照組MMP-9水平雖無顯著差異，但從第8周開始，煙熏組MMP-9水平均較對照組高。表明煙熏組MMP-9存在升高趨勢，支持煙熏導致氣道炎癥。蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組24 h的MMP-9濃度顯著大于對照組，此后，蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組MMP-9濃度與對照組雖無顯著差異但較對照組稍高。細胞因子檢測結果表明蛋白酶致炎作用較煙熏顯著，可誘導大鼠產生急性炎癥；煙熏誘導的炎癥發展緩慢，與人類COPD更相似。

COPD患者常存在體重減輕，而體重減輕可能會對COPD患者肌肉功能、健康狀態甚至預后產生影響[24-25]。本研究對大鼠體重進行檢測，發現煙熏組大鼠及蛋白酶+煙熏組大鼠體重增長較對照組緩慢，這與臨床患者表現一致。COPD患者體重減輕原因很多，如炎癥[26]，肌肉修復能力受損[27]，低氧血癥及二氧化碳潴留引起厭食[28]等。

CT是診斷COPD的重要手段，可直接觀察COPD形態學改變，并在吸煙者肺功能受損前發現肺部損害[29]。其中Micro-CT分辨率達到微米級別，可無創、清晰的觀測樣本內部顯微結構，展示疾病動態過程。本研究使用Micro-CT與病理聯合評估大鼠肺部改變，發現第4周蛋白酶組、蛋白酶+煙熏組及第8周煙熏組出現COPD表現，同時4周蛋白酶+煙熏組Micro-CT及病理改變程度均高于蛋白酶組。說明煙熏法、蛋白酶氣管滴注法及兩者相結合構建大鼠COPD模型分別需8周、4周及4周。此外，蛋白酶+煙熏法誘導COPD病變程度高于蛋白酶滴注法。

Micro-CT與病理同步觀測到模型大鼠肺部改變，表明Micro-CT對肺部改變非常靈敏，可用于無創動態監測肺部病理變化?？傊?，本研究表明使用煙熏、蛋白酶及蛋白酶+煙熏的方法均可成功構建大鼠COPD模型。煙熏大鼠模型可更好的模擬人類COPD病程，蛋白酶模型更加快速高效，而蛋白酶+煙熏模型更適于快速模擬中重度COPD。Micro-CT可靈敏真實的反應肺部病理改變。

致謝感謝于志峰博士(上海市第九人民醫院)提供圖像后處理幫助。