牙本質基質蛋白1糖基化修飾對小鼠骨骼肌損傷修復的影響

周夢琪，范琪琪，孫 瑤

（同濟大學附屬口腔醫院種植科，上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，上海 200072）

骨骼肌是一種含水量極高的彈性結締組織，在機體中發揮力量傳遞及結構支持的作用。骨骼肌損傷是運動和生活中最常見的創傷之一，損傷后骨骼肌需要經歷自我修復再生［1］。骨骼肌的損傷和再生是一個連續病理過程的不同階段，包括：骨骼肌的變性壞死，肌纖維結構破壞；炎性細胞浸潤；骨骼肌干細胞激活；再生肌纖維的分化成熟，直至肌功能恢復。骨骼肌的修復依賴多種肌再生因子發揮作用［2］。隨著年齡的增長，由于骨骼肌干細胞數量及微環境的改變，骨骼肌修復能力顯著減退［3］。

近年來，蛋白聚糖（proteoglycan，PG）在組織的發育與再生中的作用受到廣泛關注。近期有研究表明，多種蛋白聚糖在骨骼肌中隨著年齡的增長表達降低，并通過調控細胞因子及調節骨骼肌微環境影響骨骼肌再生［4?6］。牙本質基質蛋白 1（glycosyla?tion of dentin matrix protein 1，DMP1）是一種酸性細胞外基質蛋白，其蛋白質N 端（DMP1?N）經過糖基化修飾形成蛋白聚糖形式的分子 DMP1?PG［7］。DMP1?PG 在軟骨和類骨質中高度表達，并在骨發育和骨改建中發揮重要作用［8］，缺乏 DMP1?PG 的骨組織呈現老齡骨的特征［9］，并且影響骨折愈合［10］。近期研究發現在骨骼肌中存在大量DMP1?PG。然而關于DMP1?PG 在骨骼肌中增齡性變化和損傷修復中的作用無相關報道。本研究構建了DMP1 糖基化位點突變（DMP1?S89G）的小鼠，造成小鼠體內缺乏DMP1?PG，通過骨骼肌損傷模型探究 DMP1?PG 對小鼠骨骼肌損傷修復的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

DMP1?S89G 小鼠由課題組前期設計并委托北京奧賽圖生物基因技術有限公司構建。前期研究發現氨基酸S89是小鼠DMP1 主要的糖基化位點，據此采用基因敲入技術將DMP1 的絲氨酸89 替換為甘氨酸89，以干擾DMP1 的正常糖基化過程。體外和體內實驗證明S89?G89 明顯減少DMP1 糖基化水平。年輕（5 周齡）及老齡（12月齡）WT 小鼠購于上海南方模式生物有限公司。所有實驗動物在12 h光照／12 h 黑暗循環下在SPF 設施中飼養。對小鼠進行的所有實驗方案均由同濟大學動物倫理委員會（TJLAC?017?027）批準。

1.2 腓腸肌冰凍損傷模型

按照文獻［11］報道方法建立小鼠腓腸肌冰凍損傷模型。使用 5 周齡雄性 WT 小鼠和 DMP1?S89G 小鼠建立冰凍損傷模型。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（50 mg／kg）后，對手術區皮膚進行消毒，沿脛骨后側做2 cm 皮膚切口，暴露腓腸肌。將在液氮中冷卻15 s 的金屬棒置于暴露的腓腸肌表面凍融3 個循環，用4?0 絲線縫合皮膚，并將小鼠置于37 ℃的恒溫墊上2 h。

1.3 H?E染色

在冰凍損傷后2、7、14 d 及 1 個月，將小鼠麻醉處死后取傷側腓腸肌，將腓腸肌放在4%多聚甲醛中于4 ℃放置24 h 后，通過梯度乙醇脫水，包埋在石蠟中。對組織切片，每個切片 4 μm 厚。將切片脫蠟和再水化后，進行H?E 染色。

1.4 免疫熒光染色

對切片進行抗原修復并用山羊血清封閉處理。將切片與 anti?DMP1?N?9B6.3（1 ∶500；美國貝勒牙學院秦春林教授贈予）一起孵育，在4 ℃環境過夜。然后用PBS 洗滌，將切片與用熒光標記的二抗室溫敷育1 h 用DAPI 對切片進行復染色，封片后用熒光顯微鏡（Nikon Eclipse 80i，日本尼康公司）觀察。

1.5 RT?qPCR實驗

冰凍損傷后2、7、14 d，取冰凍損傷鼠傷側腓腸肌，使用Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit（瑞士Roche 公司）反轉錄提取 RNA。然后，使用FastStart Essential DNA Green Master Kit （ 瑞 士Roche 公司）和 Light Cycler 96 Instrument 系統（瑞士Roche 公司）分析靶基因的相對mRNA 表達。引物購自生物工程（上海）股份有限公司，引物序列列于表1。GAPDH 用作每個基因的內源對照。

1.6 統計學分析

實驗數據用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計學分析。采用多個獨立樣本t檢驗和多因素方差分析來驗證各組評價參數的差異。P＜0.05 為差異有統計學意義。

表1 Real?time PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences for real?time PCR

2 結 果

2.1 DMP1?PG在小鼠骨骼肌中的表達

DMP1?PG 是 DMP1 蛋白 N 端的糖基化形式，通過免疫熒光染色，用抗DMP1?N 端抗體觀察DMP1?PG 的表達，DMP1?PG 在腓腸肌纖維連接處廣泛表達（圖1A、B）。此外，與 5 周齡 WT 小鼠相比，12月齡WT 小鼠肌纖維連接處觀察到少量DMP1?PG（圖1C、D）。RT?qPCR 結果顯示，5 周齡 WT 小鼠腓腸肌DMP1?PG 相對表達量為（0.012 3±0.004 5），顯著高于12月齡小鼠腓腸肌的（0.000 5±0.000 2），差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 DMP1?PG在小鼠骨骼肌損傷修復過程中的表達

為了觀察DMP1?PG 在小鼠骨骼肌再生過程中的表達，建立了WT 小鼠腓腸肌的冰凍損傷模型。在小鼠腓腸肌損傷修復過程中，評估 DMP1?PG mRNA 表達水平，結果顯示：在腓腸肌損傷后2 d，DMP1?PG 表達有下降趨勢（P＜0.01）；損傷后 7 d，DMP1?PG 表達量顯著上調 （P＜ 0.001）；損傷后14 d，DMP1?PG 表達量下降至正常水平（圖2）。

圖1 DMP1?PG 在小鼠骨骼肌中的表達Fig.1 Expression of DMP1?PG in mouse skeletal muscle

圖2 DMP1?PG 在小鼠骨骼肌損傷后不同時間點的表達Fig.2 Expression of DMP1?PG at different time points after mouse skeletal muscle injury

2.3 DMP1?PG缺失抑制小鼠骨骼肌損傷修復

為了進一步探究DMP1?PG 在小鼠骨骼肌損傷修復中的作用，對 5 周齡 WT 小鼠和 DMP1?S89G小鼠建立冰凍損傷模型，分別于損傷后2、7、14、30 d收取損傷腓腸肌。H?E 染色顯示，損傷后 2 d，WT小鼠損傷處肌纖維腫脹壞死，大量炎性細胞浸潤，DMP1?S89G 小鼠炎性細胞浸潤較少；骨骼肌損傷后7 d，WT 小鼠損傷處出現大量中央成核肌纖維；損傷后14 d，出現大量多核肌纖維融合形成的肌管，DMP1?S89G 小鼠損傷后7 d 中央成核肌纖維形成較少，損傷后14 d 多數肌纖維仍處于融合狀態；損傷后1 個月，WT 小鼠損傷處出現大量成熟肌纖維，DMP1?S89G 組成熟肌纖維較少。說明在冰凍損傷后，在WT 野生型小鼠中，骨骼肌能夠較快的修復，但是在缺乏DMP1?PG 的小鼠模型中，肌肉損傷修復的速度減緩，呈現明顯修復不良（圖3）。

圖3 損傷后不同時間點小鼠骨骼肌H?E 染色Fig.3 Histological characterization of mouse skeletal muscle using H?E staining （Scale bar＝100 μm）

2.4 DMP1?PG缺失抑制小鼠骨骼肌再生相關因子的表達

為探究DMP1?PG 影響小鼠骨骼肌損傷修復的機制，使用 RT?qPCR 測定損傷后 2、7、14 d 小鼠腓腸肌肌再生相關因子的表達。結果顯示，損傷后2 d，MyoD mRNA 的表達顯著上調，而 DMP1?S89G小鼠MyoD mRNA 表達量顯著低于WT 小鼠（P＜0.000 1），見圖4A。HGF 和 Myf5 mRNA 表達相似，損傷后2、7、14 d 其表達量顯著增加；在損傷后2 d，DMP1?S89G 小鼠 HGF 和 Myf5 mRNA 表達量顯著低于 WT 小鼠（P＜0.01），見圖4C、E。Myoge?nin mRNA 表達量在損傷后 2、7、14 d 顯著上調，且在損傷后 2、7 d，DMP1?S89G 小鼠的表達量均顯著低于 WT 小鼠（P＜0.000 1），見圖4B。損傷后 2、7 d，MGF 表達量顯著上調，而損傷后 7 d DMP1?S89G 小鼠的表達量顯著低于 WT 小鼠（P＜0.001），見圖4D。在損傷后 2、7、14 d，Myosatin mRNA 表達量顯著下調，但在 DMP1?S89G 小鼠和 WT 小鼠中表達差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4F。

圖4 DMP1?PG 缺失對損傷后小鼠骨骼肌再生因子表達的影響Fig.4 Effect of reduced DMP1?PG on the expression of regeneration factors in mouse skeletal muscle after injury

2.5 DMP1?PG缺失抑制小鼠骨骼肌血管再生相關因子的表達

RT?qPCR 檢測結果顯示，DMP1?PG 糖基化減少會顯著抑制小鼠腓腸肌損傷后2 d VEGF mRNA的表達（P＜0.01），見圖5A；而 HIF?1α mRNA 的表達在損傷后2 d 顯著上調（P＜0.000 1），見圖5B；損傷后 2、7、14 d，Angpt1 mRNA 的表達在 DMP1?S89G 組顯著上調（P＜0.01），見圖5C。

圖5 DMP1?PG 減少對損傷后小鼠骨骼肌血管再生因子表達的影響Fig.5 Effect of reduced DMP1?PG on the expression of angiogenesis factors in mouse skeletal muscle after injury

3 討 論

骨骼肌再生是一個受多種因素調節的復雜過程，其再生過程分為 3 個階段［12］。第 1 階段為損傷炎癥期，發生于損傷的早期，此時肌纖維結構破壞，周圍有大量炎性細胞浸潤。第2 階段為損傷修復期，出現在損傷后5 ～10 d，原本靜息狀態下的骨骼肌干細胞被激活，遷移、增殖、分化，與損傷的肌纖維融合以修復受損骨骼肌。第3 階段發生于損傷后14～21 d，此時再生的肌纖維成熟，稱為組織塑形期［1，13?14］。此過程受多種因素影響，其中存在于細胞外基質中的多種蛋白聚糖，在骨骼肌的發育和再生中的作用在近年來引起了關注。蛋白聚糖通過調控一些細胞因子，如 MGF［15］和 HGF［16?17］影響骨骼肌干細胞的活化、遷移和增殖，從而影響骨骼肌的發育、修復。隨著年齡的增長，骨骼肌中大多數蛋白聚糖表達減少，骨骼肌再生能力下降［18］。研究結果表明，表達多配體蛋白聚糖syndecan 的骨骼肌干細胞數量隨著年齡的增長而降低［19?20］。

DMP1 是一種在機體中廣泛分布的酸性蛋白，水解后斷裂成 DMP1?NH2端（簡稱 DMP1?N）和 DMP1?COOH 端（簡稱 DMP1?C）。DMP1?N 通過共價鍵連接一個糖胺聚糖鏈形成DMP1?PG，具有蛋白聚糖的特性，其在未礦化的類骨質、前期牙本質、軟骨基質中大量表達，參與牙本質和骨的礦化，調節骨改建，維持骨細胞外基質環境穩態［21?22］。研究表明，老齡小鼠骨組織中 DMP1?PG 表達下降，DMP1?PG 減少會導致牙本質變薄，骨組織骨量下降，骨脆性增加，呈現老齡骨特性［9］，并且 DMP1?PG 的缺乏會導致骨折愈合異常［10］。近年來的研究也發現 DMP1?PG 在多種軟組織，如血腦屏障中表達，并發揮關鍵作用［23］。作為機體重要的軟組織，骨骼肌也有DMP1?PG 的表達，但DMP1?PG 在骨骼肌中的增齡性變化及對骨骼肌損傷修復的影響有待進一步揭示。

在本研究中，首先檢測了 DMP1?N／DMP1?PG在小鼠骨骼肌中的增齡性表達變化，結果顯示DMP1?N／DMP1?PG 集中表達在年輕小鼠骨骼肌肌纖維連接處，而在老齡小鼠骨骼肌中表達顯著下降。為了進一步探討DMP1?PG 是否會影響小鼠骨骼肌生成和維持，從而影響骨骼肌損傷修復，對年輕小鼠建立了經典的骨骼肌損傷模型，并檢測有無DMP1?PG 對于骨骼肌的影響。利用RT?qPCR 實驗檢測冰凍損傷后不同修復時間點骨骼肌DMP1?PG mRNA的表達水平，結果顯示，損傷后 2 d，DMP1?PG 表達有下降趨勢，這可能是由于損傷處肌肉組織結構被嚴重破壞導致，而損傷后7 d 表達顯著上調，損傷后14 d DMP1?PG 表達恢復至正常水平。這些結果提示，DMP1?PG 參與小鼠骨骼肌損傷修復過程。氨基酸S89是小鼠DMP1 唯一的糖基化位點，并高度保守，據此本研究通過基因敲入技術將該位點的絲氨酸替換為甘氨酸，干擾DMP1 的糖基化過程，構建了一種缺乏 DMP1?PG 的 DMP1?S89G 小鼠，H?E 結果顯示，與 WT 小鼠相比，DMP1?S89G 小鼠骨骼肌損傷后炎性細胞浸潤較少，損傷后7 d 中央成核的再生肌纖維形成減少，再生肌纖維融合、成熟過程滯后。本研究結果表明，DMP1?PG 缺失會抑制小鼠骨骼肌損傷后修復的關鍵過程。

肌肉組織是一種內分泌器官，骨骼肌再生受到多種因子的調控［24］。骨骼肌再生受到肌源性調控因子（MRFs）MyoD、myogenin、Myf5 表達調控［25］。MyoD 和Myf5 協同作用使骨骼肌干細胞進入細胞增殖周期并調控其分化，缺乏MyoD 會導致骨骼肌干細胞分化延遲，當敲除MyoD 和Myf5 的基因后，增殖的干細胞無法進一步分化［26］。Myogenin 也參與骨骼肌干細胞細胞分化，是干細胞分化標志物［27］。同時骨骼肌干細胞的激活、增殖、活化還受到 Myostain 的負調控［28］。骨骼肌受損后，除了肌肉本身，血管、浸潤的炎性細胞、細胞外基質也會釋放相關因子，誘導骨骼肌再生，包括成MGF 和HGF。本研究測定了上述因子在小鼠骨骼肌損傷修復過程中的表達，結果顯示骨骼肌損傷后多種MRF 表達顯著上調，參與骨骼肌損傷后修復；而當DMP1?PG 缺失后，這些肌再生因子的表達則顯著下調。這說明DMP1?PG 缺失后小鼠骨骼肌損傷修復異?？赡苁怯捎诩≡偕蜃颖磉_受到抑制。此外，血管再生也是骨骼肌損傷后修復的重要環節，新生的血管可為骨骼肌再生提供營養和氧氣，并且維持骨骼肌所處環境的穩態［29?30］。有研究表明 HIF?1α、Angpt1 和VEGF 可直接參與骨骼肌損傷修復［31?33］。本研究結果顯示，DMP1?PG 缺失后在小鼠骨骼肌損傷修復過程中 VEGF 表達下降，HIF?1α、Angpt1 表達上升，說明損傷處新生血管較少，損傷處缺氧狀態改善不足，提示DMP1?PG 缺失后損傷小鼠骨骼肌的血管再生受到抑制，進而抑制骨骼肌再生。

綜上，本研究結果表明DMP1?PG 在小鼠骨骼肌中增齡性減少，并參與了小鼠骨骼肌損傷修復過程。冰凍損傷后，在缺乏DMP1?PG 的小鼠模型中，肌肉損傷修復的速度減緩，修復成度明顯不良，且這種抑制作用可能與DMP1?PG 缺失導致的肌再生相關因子和血管再生因子表達異常有關。但是當DMP1?PG 恢復至正常水平后，小鼠骨骼肌損傷后修復能力是否能恢復正常，DMP1?PG 在肌肉再生和肌肉干細胞分化過程中的作用還需要進一步探討。