補陽還五湯對Cav-1敲除小鼠腦缺血后mTOR通路的影響

陳博威　周勝強　易健　羅琳　劉柏炎　謝勇

〔摘要〕 目的 探討小窩蛋白（caveolin-1， Cav-1）對腦缺血后哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信號通路的影響及補陽還五湯抗腦缺血的可能作用機制。方法 將Cav-1基因敲除（knock out， KO）與野生型（wild type， WT）小鼠隨機分為KO假手術組、KO模型組、KO補陽還五湯組（補陽組）、WT假手術組、WT模型組及WT補陽組。采用大腦中動脈栓塞法建立腦缺血模型，干預14 d后觀察小鼠神經功能評分;免疫組化檢測大腦mTOR、磷酸化核糖體S6蛋白激酶（phospho-ribosomal S6 kinase， p-S6K1）、磷酸化真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白-1（phospho-eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1， p-4E-BP1）的蛋白表達;qRT-PCR檢測大腦mTOR的mRNA水平。結果 與同類假手術組比較，其他4組神經功能評分、mTOR、p-S6K1、p-4E-BP1蛋白表達及mTOR mRNA表達明顯上升（P<0.01）;與同類模型組比較，KO補陽組、WT補陽組神經功能評分明顯下降（P<0.01），各蛋白表達與mRNA表達明顯上升（P<0.01）;與WT模型組比較，KO模型組神經功能評分上升（P<0.05），各蛋白與mRNA表達明顯下降（P<0.01）;與WT補陽組比較，KO補陽組神經功能評分明顯上升（P<0.01），各蛋白及mRNA明顯下降（P<0.01）。結論 Cav-1基因的缺失會導致mTOR通路活性降低并加重腦缺血后神經功能損傷;補陽還五湯可能通過Cav-1調控mTOR信號通路的活性，發揮抗腦缺血損傷的作用。

〔關鍵詞〕 腦缺血;mTOR信號通路;補陽還五湯;Cav-1基因敲除

〔中圖分類號〕R285.5;R743.3? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.04.007

Effects of Buyang Huanwu Decoction on mTOR Pathway in Cav-1 Knock Out

Mice after Cerebral Ischemia

CHEN Bowei1， ZHOU Shengqiang2， YI Jian3， LUO Lin1， LIU Baiyan1，4*， XIE Yong5

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Affiliated Hospital of Hunan Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 4. Yiyang Medical College， Yiyang， Hunan 413000， China; 5. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of caveolin-1 （Cav-1） on mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway after cerebral ischemia and the possible mechanism of Buyang Huanwu Decoction （BHD） in anti-cerebral ischemia. Methods Cav-1 knock out mice （KO） and wild type mice （WT） were randomly divided into a KO sham operation group， a KO model group and a KO BHD group， a WT sham operation group， a WT model group， and a WT BHD group. Cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion （MCAO）. After 14 days of intervention， the neurological function scores of each group were observed. The protein expression of mTOR， phospho-Ribosomal protein S6 kinase beta-1 （p-S6K1）， phospho-eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 （p-4E-BP1） were detected by immunohistochemical method， and mTOR mRNA was detected by qRT-PCR. Results Compared with the sham group， the neurological function scores， the expression of mTOR， p-S6K1， p-4E-BP1 protein and mTOR mRNA of the other 4 groups were significantly increased （P<0.01）. Compared with the similar model group， the neurological function scores of the KO BHD group and the WT BHD group decreased significantly （P<0.01）. The expression of each protein and mRNA increased significantly （P<0.01）. Compared with the WT model group， the neurological function scores of the KO model group increased （P<0.05）， and the expression of each protein and mRNA decreased significantly （P<0.01）. Compared with the WT BHD group， the neurological function scores of the KO BHD group increased significantly （P<0.01）， and each protein and mRNA decreased significantly （P<0.01）. Conclusion The deletion of Cav-1 gene can reduce the activity of mTOR pathway and aggravate the neurological damage after cerebral ischemia; BHD may regulate the activity of mTOR signaling pathway through Cav-1 and play a role in resisting cerebral ischemic injury.

〔Keywords〕 cerebral ischemia; mTOR signaling pathway; Buyang Huanwu Decoction; Cav-1 gene knock out

缺血性腦血管疾病因其高發病率、高死亡率和高致殘率給社會、患者家庭及個人帶來沉重的痛苦和負擔[1]。小窩蛋白（caveolin-1， Cav-1）在腦缺血損傷中具有抑制炎癥反應[2]、促進血管新生作用[3]，因而改善保護神經。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信號通路是一條能調控細胞生長[4]、蛋白合成及自噬的經典通路[5]。課題組前期研究表明，Cav-1可以通過調控mTOR/失調51樣激酶1（uncoordinated 51 like kinase-1， ULK1）通路的活性，抑制腦缺血后半暗帶自噬，減輕腦缺血損傷[6]。但是Cav-1是否能在腦缺血后通過mTOR通路調控細胞生長及蛋白質合成來減輕腦損傷，目前還未見報道。補陽還五湯作為治療缺血性中風氣虛血瘀證的經典名方，其療效已經經過臨床證實[7]。本研究以Cav-1基因敲除小鼠作為研究對象，通過觀察腦缺血小鼠神經功能評分、mTOR的蛋白與mRNA及其下游效應因子磷酸化核糖體S6蛋白激酶（phospho-ribosomal S6 kinase， p-S6K1）、磷酸化真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白-1（phospho-eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1， p-4E-BP1）的蛋白表達，探討Cav-1對腦缺血后

mTOR通路的影響及補陽還五湯對腦缺血小鼠的療效機制。

1 材料

1.1? 動物

健康雄性Cav-1基因敲除（knock out， KO）小鼠與同源野生型（wild type， WT）C57小鼠，各40只。其中KO小鼠購自美國JacksonLaboratory，批號：2909619，在湖南中醫藥大學動物中心自行繁衍，均經PCR鑒定為Cav-1基因敲除[8]，自由飲水進食，光照規律。

1.2? 藥物

補陽還五湯按《醫林改錯》原方組成：黃芪120 g，當歸尾6 g，川芎3 g，紅花3 g，赤芍4.5 g，桃仁 3 g，地龍3 g，飲片自湖南中醫藥大學第一附屬醫院購買。常規煎煮后濃縮至含生藥2 g/mL，冷藏備用。

1.3? 主要試劑與儀器

mTOR抗體、p-S6K1抗體、p-4E-BP1抗體、SABC-POD試劑盒（武漢博士德公司）;TRIzol Reagent（美國Life Technologies公司）;RevertAidFirst Strand cDNA合成試劑盒（美國Thermo公司）;PCR引物合成（上海生工生物工程公司），引物序列：β-actin-F：5-GCAGATGTGGATCAGCAAGC-3，β-actin-R：5-AGGGTGTAAAACGCAGCTCAG-3，片段長度：102 bp;

mTOR-F：5-GGATGCAGTGGCGACATTTG-3，mTOR-

R：5-TTTCAGCATCGTGGGGTCAG-3，片段長度：79? bp。

EG1150H石蠟包埋機、RM2235切片機（德國萊卡公司）;BX71顯微鏡（日本奧林巴斯公司）;PCR擴增儀（美國BioRad公司）;核酸水平電泳儀（北京百晶生物技術公司）;核酸蛋白濃度測定儀（英國BIO-DROP公司）。

2 方法

2.1? 分組造模與干預

將KO小鼠及WT小鼠按照隨機數字表法分為KO假手術組、KO模型組、KO補陽還五湯組（補陽組）、WT假手術組、WT模型組及WT補陽組，運用大腦中動脈栓塞法復制腦缺血模型，每組12只。造模方法：將大鼠麻醉后固定，取頸正中切口，游離左側頸總、頸內、頸外動脈，依次結扎頸總動脈、頸外動脈。于頸總動脈分叉部下方0.2～0.3 cm處剪一小口，將魚線通過頸總動脈，插入頸內動脈，遇到輕微阻力后停止進線，深度（7.5±0.5） mm，固定魚線并逐層縫合切口。假手術組僅切開皮膚、分離頸內動脈、頸外動脈后即縫合。術后2 h進行模型評分。參照Longa等[9]報道的5分法進行神經功能評分。分值在1～3分表明造模成功，予以納入研究。補陽組于術后2 h開始給藥，給藥劑量為每日18.5 g/kg（按70 kg成人與動物體質量藥量折算表換算），模型組和假手術組小鼠均給予等量蒸餾水，每日灌胃1次，持續14 d。

2.2? 檢測指標

2.2.1? 神經功能評分? 運用Ayelet Levy 14分評分法評估神經功能[10]。（1）運動試驗（正常=0;最大值=3）：提住尾巴將大鼠逐漸提高：前肢屈曲計1分，后肢屈曲計1分，30 s內頭移動與縱軸形成角度>10°計1分;（2）爬行姿勢測試（正常=0;最大值=3）：將大鼠置于地面：正常爬行計0分，無法直線爬行計1分，沿患側轉圈計2分，患側跌倒計3分;（3）梁平衡測試（正常=0;最大值=6）：靜態姿勢下可平衡計0分，抓握梁邊計1分，抱住梁，有一肢體掉落計2分，抱住梁，有兩肢體掉落，或在梁上旋轉（>60 s）計3分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>40 s）計4分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>20 s）計5分，跌落且沒有試圖保持平衡或抓梁（<20 s）計6分;（4）反射缺失或異常動作（正常=0;最大值=2）：耳廓反射（當觸耳道時搖頭）計1分，角膜反射（用棉花絲輕觸角膜可閉眼）計1分。4個實驗共計14分，分數越高，神經功能損傷越大。

2.2.2? 免疫組化檢測蛋白表達? 小鼠處死后用4%多聚甲醛固定大腦，脫水后常規包埋，切片，厚度約4 μm，依次烤片、脫蠟水化，用3%過氧化氫去離子水滅活，熱修復抗原，BSA封閉液封閉，加入適量一抗4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗后二抗孵育，再次PBS沖洗滴加增敏液孵育，最后DAB顯色并梯度脫水，透明，封片。每只大鼠取5張切片，使用OlympusBX71光學顯微鏡在200高倍鏡下觀察，運行Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算陽性細胞數。另因一抗特性不同，p-S6K1、p-4E-BP1指標在DAB染色后再用蘇木素復染，使用OlympusBX71光學顯微鏡在200倍高倍鏡下觀察，運行Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算平均光密度。

2.2.3? qRT-PCR檢測mRNA表達? 從引物銀行下載基因序列，用Primer premier 6.0進行引物設計，并由上海生工合成。運用Trizol法提取腦組織總RNA;檢測RNA濃度及質量;以Oligo（dT）18為引物采用兩步法逆轉錄cDNA：變性RNA，逆轉錄成cDNA;PCR反應：預變性溫度95 ℃ 2 min，變性溫度95 ℃ 15 s，退火溫度59.2～60.8 ℃，循環40次。溶解曲線反應程序為95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，溫度緩慢上升（20 min）。內參基因選用β-actin，采用2 -△△Ct進行相對定量，表示該基因的相對表達水平。

△Ct值=基因Ct值-內參Ct值

△△Ct值=實驗組△Ct值-對照組△Ct值

2.3? 統計學分析

運用SPSS 21.0統計軟件以及Graphpad Prism 8作圖軟件分析并處理。計量資料均以“x±s”進行統計，符合正態性分布的組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組小鼠神經功能評分的比較

與同類型小鼠假手術組比較，KO模型組、KO補陽組、WT模型組及WT補陽組神經功能評分明顯上升（P<0.01）;與同類型小鼠模型組比較，KO補陽組、WT補陽組神經功能評分明顯下降（P<0.01）;與WT模型組比較，KO模型組神經功能評分增高（P<0.05）;與WT補陽組比較，KO補陽神經功能評分明顯增高（P<0.01）。見表1。

3.2? 各組小鼠mTOR、p-S6K1、p-4E-BP1蛋白表達的比較

與同類假手術組比較，KO模型組、KO補陽組、WT模型組及WT補陽組mTOR、p-S6K、p-4E-BP1蛋白表達升高（P<0.01）;與同類模型組比較，KO補陽組、WT補陽組各蛋白表達上升（P<0.01）;與WT模型組相比，KO模型組各蛋白表達明顯降低（P< 0.01）;與WT補陽組比較，KO補陽各蛋白表達明顯降低（P<0.01）。詳見圖1-圖3。

3.3? 各組小鼠mTOR mRNA表達的比較

與同類假手術組比較，KO模型組、KO補陽組、WT模型組及WT補陽組mTOR mRNA表達升高（P<0.01）;與同類模型組比較，KO補陽組、WT補陽組mRNA表達上升（P<0.01）;與WT模型組相比，KO模型組mTOR mRNA表達明顯下降（P<0.01）;與WT補陽組比較，KO補陽mTOR mRNA表達明顯降低（P<0.01）。詳見圖4。

4 討論

中醫學將腦缺血歸納于“中風病”范疇，認為其是在氣血陰陽虧損的基礎上，加之飲酒飽食或情志刺激等誘因，致人體臟腑陰陽失調，氣血運行失約，上沖于腦，而發為中風。補陽還五湯由清代王清任所創，本方重用生黃芪為君藥以大補元氣;配以當歸尾活血和血為臣藥;紅花、桃仁、川芎、赤芍助當歸活血祛瘀，地龍長于行散走竄，通經活絡，均為佐藥。全方共奏，使氣旺促血行，活血而不傷正，則筋肉得養，痿廢可愈，臨床上常用于治療缺血性中風氣虛血瘀之證。課題組前期研究表明，補陽還五湯能在腦缺血后通過降低炎癥反應[11]、抑制細胞凋亡[4]、促進血管新生[3]、減少細胞自噬[12]等途徑發揮抗腦缺血損傷作用。

腦缺血的發病機制十分復雜，但不管哪種原因導致的腦缺血，其治療方法均以改善腦代謝，促進受損腦組織血管重構及誘發神經再生為主。mTOR是細胞生長和增殖的關鍵調節分子，具有調控細胞生長、蛋白質合成及細胞自噬的作用[13]?；罨蟮膍TOR則進一步使下游底物S6K1、4E-BP1磷酸化，此兩者是相互平行的信號分子，其中4E-BP1在正常狀態下會與真核細胞翻譯啟動因子（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）緊密結合，阻止帽依賴性翻譯的開始，當4E-BP1磷酸化時則會與eIF4E分離，啟動蛋白質的翻譯，促進細胞生長;而p-S6K1可以繼續活化細胞底物，促進蛋白翻譯，抑制細胞凋亡，對細胞生長同樣有著調節作用[14]。因此，通過改善腦缺血后mTOR通路的活性，促進受損腦組織的蛋白合成，可能是治療腦缺血的潛在靶點，我們推測補陽還五湯可能通過mTOR通路發揮抗腦缺血損傷的作用。

小窩是細胞膜上的特殊凹陷，是各類細胞信號分子的聚集地。Cav-1是小窩中重要的功能結構與核心蛋白，可通過激活下游各類效應因子，廣泛參與了細胞生長、分化、凋亡等各個病理生理過程[15]，為細胞內信號傳導的樞紐。課題組前期研究發現缺血性腦損傷能上調大鼠腦內Cav-1的表達[16]，而Cav-1敲除則降低腦缺血早期腦內細胞的增殖并增強膠質活化，加重了腦缺血損傷[17]。隨著對Cav-1研究的深入，我們發現Cav-1可以通過降低炎癥反應、促進血管新生、抑制細胞自噬與促進神經再生等各種途徑[18]，對腦缺血后損傷神經有保護作用[19]。那么mTOR作為能夠調控細胞生長和增殖的關鍵信號通路，Cav-1的神經保護作用是否與改善腦缺血后mTOR通路的活性來促進蛋白合成及細胞生長有關呢？

本研究發現腦缺血后小鼠mTOR的蛋白及mRNA表達上升、p-S6K1、p-4E-BP1的蛋白表達同樣上升，但整體活化程度有限，無法完全修復受損神經，仍有明顯神經功能缺損。補陽還五湯的干預讓其調控作用更加明顯，并能顯著改善神經功能評分，表明補陽還五湯能夠調控mTOR通路相關的活性，改善神經功能評分，推測補陽還五湯的抗腦缺血損傷的作用可能與調控mTOR通路，促進損傷神經的蛋白合成及細胞生長相關。值得注意的是，本研究還發現，與WT組小鼠相比，KO組小鼠腦缺血后神經功能評分改善較低，mTOR通路相關因子的活性受損，表明Cav-1的缺失能夠影響mTOR通路的活性，加重腦缺血后神經功能損傷。

綜上所述，本研究發現Cav-1基因的缺失會導致mTOR通路活性降低并加重腦缺血后神經功能損傷;此外，本研究還初步驗證了補陽還五湯的干預可以影響腦缺血后mTOR信號通路的活性，并改善腦缺血損傷，但是目前還無法肯定其作用機制與

mTOR信號通路相關。課題組將從上述思路出發，采取Cav-1敲除及mTOR抑制劑雙重阻斷Cav1/mTOR信號通路的方式，進一步明確補陽還五湯抗腦缺血損傷的作用機制。

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〔收稿日期〕2019-11-12

〔基金項目〕國家自然科學基金項目（81273989）;湖南省自然科學基金項目（2018JJ2413、2018JJ3383）;湖南省中醫藥管理局項目（2015140）。

〔作者簡介〕陳博威，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫藥防治心腦血管疾病。

〔通訊作者〕*劉柏炎，男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：liubaiyan@126.com。