微擬球藻脂質的亞臨界提取工藝優化及其成分分析

賀 瑤，曹 健，何東平,2，鄭竟成,2

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023； 2.大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，武漢 430023)

微擬球藻，原屬于綠藻門，后被劃歸為真眼點藻綱，是一種分布廣泛的海水藻，也是公認的最有希望用于工業化的高產油藻類。微擬球藻富含各種不飽和脂肪酸，其中二十碳五烯酸(EPA)含量可達總脂肪酸的30%左右，因此被稱為最有潛力的EPA研究藻種之一[1]。作為一種單細胞藻類，微擬球藻除了脂質含量高，還具有環境適應能力強、個體小、繁殖速度快等特點。因此，微擬球藻及其脂質的開發與利用近年來受到廣泛的研究。

EPA屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸，可降低甘油三酯和膽固醇的含量，促進飽和脂肪酸在體內的代謝[1-4]。在現代人的日常飲食中，膽固醇和油脂的攝入量大幅上升，導致心血管疾病成為了主要的健康問題之一。而EPA已被證實對治療動脈粥樣硬化、高血壓和炎癥有效[4-5]。因此，研究開發富含EPA的產品具有廣闊的應用前景及經濟價值。微藻中脂肪酸組成穩定、培養繁殖簡單、生長周期短，因此微藻作為EPA等不飽和脂肪酸的來源之一具有很大的發展潛力。

亞臨界流體提取技術具有很多獨特的優點，如提取效率高、提取壓力低、提取溫度低等，已被廣泛應用于植物脂質[6-7]和動物脂質[8-10]的提取，但將該技術應用于微擬球藻脂質的提取鮮有報道。亞臨界流體提取技術應用于微擬球藻脂質的提取可以保護多不飽和脂肪酸等生物活性物質，最大程度地減少氧化的發生。本文以微擬球藻膨化料為原料，采用亞臨界流體丁烷提取技術對微擬球藻脂質進行提取，在單因素試驗的基礎上利用正交試驗對影響微擬球藻脂質提取率的參數進行優化，確定最佳工藝條件，并檢測其基本物性指標，為微擬球藻脂質的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

微擬球藻膨化料，煙臺海融微藻養殖有限公司；脂肪酸、磷脂標準品，美國Sigma公司；乙醇、硫代硫酸鈉、氫氧化鉀、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀等均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設備

馬弗爐；1100高效液相色譜儀、8860氣相色譜儀，美國安捷倫科技公司；CBE-5L亞臨界丁烷提取裝置，河南亞臨界生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質

稱取500 g微擬球藻膨化料，以丁烷為提取溶劑，在一定條件下進行亞臨界動態提取，提取完畢后，減壓蒸發，收集微擬球藻脂質，計算微擬球藻脂質提取率[8]。每個樣品做3次平行試驗，取平均值。微擬球藻脂質提取率按下式計算。

微擬球藻脂質提取率=亞臨界提取脂質提取量/索氏抽提脂質提取量×100%

1.2.2 微擬球藻脂質相關指標分析

酸價，GB 5009.229—2016第二法；過氧化值，GB 5009.227—2016第二法；碘值，GB/T 5532—2008；脂肪和脂肪酸組成，GB 5009.168—2016第一法；磷脂含量，GB/T 5537—2008。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取次數對提取率的影響

在提取溫度45℃、單次提取時間40 min、料液比1∶8的條件下，按提取次數分別為1、2、3、4、5、6 次進行亞臨界丁烷提取，考察提取次數對微擬球藻脂質提取率的影響，結果見圖1。

圖1 提取次數對微擬球藻脂質提取率的影響

由圖1可知，隨著提取次數的增加，提取率不斷增加。從第1次到第4次，提取率迅速增加，達到41.01%；從第4次增至第6次，提取率趨于平緩，繼續增加提取次數意義不大。為了適當簡化操作的流程，減少能量的損耗，提高效率，將提取次數確定為4次。

2.1.2 單次提取時間對提取率的影響

在提取溫度45℃、料液比1∶8、提取4次的條件下，按單次提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min進行亞臨界丁烷提取，考察單次提取時間對微擬球藻脂質提取率的影響，結果見圖2。

圖2 單次提取時間對微擬球藻脂質提取率的影響

由圖2可知，隨著單次提取時間的延長，提取率逐漸上升。單次提取時間從10 min延長至40 min時，提取率增至41.13%。隨后單次提取時間逐漸延長至60 min，提取率增加變緩。10～20 min時提取剛開始，此時細胞內部油脂還未向外部溶劑擴散[11]，因此提取率較低；隨著提取時間的延長，在20～40 min時細胞內部油脂向外部溶劑擴散，提取率快速升高，40 min時基本達到最高值；40 min 之后提取逐漸達到平穩階段以及慢速傳質階段，細胞內部油脂向外部溶解擴散達到動態平衡之后，提取率增加不明顯。綜上，選擇單次提取時間40 min為宜。

2.1.3 提取溫度對提取率的影響

在料液比1∶8、單次提取時間40 min、提取4次的條件下，按提取溫度分別為30、35、40、45、50、55℃進行亞臨界丁烷提取，考察提取溫度對微擬球藻脂質提取率的影響，結果見圖3。

圖3 提取溫度對微擬球藻脂質提取率的影響

由圖3可知：當提取溫度在45℃以下時，隨著提取溫度的升高，微擬球藻脂質提取率隨之增加，當提取溫度達到45℃時，提取率達到最大；但提取溫度超過45℃后，隨著丁烷分子運動加速導致其密度有所降低，汽化程度增加，與物料接觸面積減少，使提取速率逐漸下降[12]。此外，提取溫度升高還會加速脂質中不飽和脂肪酸的分解，故最佳提取溫度選擇45℃。

2.1.4 料液比對提取率的影響

在提取溫度45℃、單次提取時間40 min、提取4次的條件下，按料液比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12進行亞臨界丁烷提取，考察料液比對微擬球藻脂質提取率的影響，結果見圖4。

圖4 料液比對微擬球藻脂質提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，提取率逐漸升高，但在料液比超過1∶8后，提取率增加不明顯，說明此時微擬球藻中的脂溶性成分幾乎提取完全，因此提取率基本穩定，上升緩慢。若繼續增加丁烷的用量，會降低總體提取效率，也會增加能耗。綜合考慮，選擇料液比1∶8。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以提取率為評價指標，采用四因素三水平正交試驗表L9(34)，優化亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質的工藝條件。選取提取次數、單次提取時間、提取溫度、料液比作為優化因素，正交試驗因素水平見表1，正交試驗設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設計及結果

由表2可知，各因素對微擬球藻脂質提取率影響的主次排序為A>B>C>D，即提取次數>單次提取時間>提取溫度>料液比。工藝參數最佳組合為A2B2C2D2，即提取次數4次，單次提取時間40 min，提取溫度45℃，料液比1∶8。

2.3 驗證試驗

取同一批次微擬球藻膨化料3份，每份500 g，在提取次數4次、單次提取時間40 min、提取溫度45℃、料液比1∶8的條件下進行3組平行試驗，微擬球藻脂質的平均提取率為41.55%，說明工藝穩定可行。在最佳條件下提取的微擬球藻脂質呈深綠色油性糊狀，其酸價(KOH)20.4 mg/g，過氧化值0.001 g/100 g，碘值(I)86.0 g/100 g，磷脂含量107.28 mg/g。

與其他油脂提取相比，微擬球藻脂質提取率整體偏低，可能是因為雖然經過了膨化處理，但是微擬球藻的破壁率并不高，導致了在提取過程中，有機溶劑不能很好地滲透到微藻細胞內，從而造成整體提取率偏低。

2.4 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質的脂肪分析

亞臨界丁烷提取的微擬球藻脂質中含有豐富的脂肪，通過內標法對脂肪的組成和含量進行了分析，結果見表3。

表3 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質中脂肪組成及含量

由表3可知，亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質總脂肪含量40.22%，其中飽和脂肪含量14.51%，不飽和脂肪含量25.71%。ω-3脂肪含量7.24%，ω-6脂肪含量3.30%，ω-9脂肪含量4.39%。對亞臨界丁烷提取的微擬球藻脂質成分進行進一步分析，發現其中還含有甘露醇、葉綠素、類胡蘿卜素、植物甾醇等其他成分。

為進一步了解微擬球藻脂質的脂肪酸組成，利用GC對微擬球藻脂質中的脂肪酸組成進行了檢測，結果見表4。

表4 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質中主要脂肪酸組成及含量

由表4可知，微擬球藻脂質中脂肪酸主要以不飽和脂肪酸為主，其中EPA含量為7.21%。本次測定的微擬球藻脂質中的EPA含量，相較于一些報道[13]偏低，推測與藻粉批次和藻粉的膨化工藝有關，但不影響對亞臨界丁烷提取工藝的研究。

3 結 論

通過單因素試驗和正交試驗確定了亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質的最佳工藝條件為：提取次數4次，單次提取時間40 min，提取溫度45℃，料液比1∶8。在最佳工藝條件下，微擬球藻脂質提取率為41.55%。提取的微擬球藻脂質呈深綠色油性糊狀，其酸價(KOH)20.4 mg/g，碘值(I)86.0 g/100 g，過氧化值0.001 g/100 g，磷脂含量107.28 mg/g。亞臨界丁烷提取的微擬球藻脂質中總脂肪含量為40.22%，不飽和脂肪酸含量較高，其中EPA含量為7.21%。