廣東漢族人群Penta D基因座off-ladder稀有等位基因分析

蘭菲菲 周偉寧 陳延冰 丁紅珂

(廣東省婦幼保健院 醫學遺傳中心，廣東 廣州 511442)

短串聯重復序列(short tandem repeat，STR)是由2～8個堿基組成核心序列的一類DNA遺傳標記，遵循孟德爾遺傳定律[1]。STR基因座核心序列的重復數目在不同個體中存在差異，具有高度的遺傳多態性，STR基因座的等位基因分型作為第二代法醫DNA分型技術廣泛應用于法醫遺傳學的親權鑒定和個體識別[2]。目前應用于法醫遺傳學的檢測試劑盒中等位基因分型標準物(allelic ladder)中包含了試劑盒所使用的每個STR基因座的人群中常見等位基因分型[3]。隨著STR基因座遺傳標記在法醫遺傳學應用的顯著增加及不同種族和民族等位基因分型的差異，越來越多的等位基因分型標準物之外的(off- ladder，OL)等位基因被發現[4]。我們應用Powerplex21體系檢測廣東地區漢族人群中Penta D基因座的OL等位基因現象，并計算/命名OL的等位基因分型，正確判讀鑒定結果，為廣東地區漢族人群Penta D基因座OL等位基因分型提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 親子鑒定家系來自廣東省婦幼保健院2016～2018年受理的辦理入戶鑒定案件和個人了解的案件，篩選廣東籍漢族人群列為研究對象。研究家系為生母、孩子和被檢父的三聯體親子鑒定或者父子/女、母子/女的二聯體親子鑒定，簽署知情同意書后采集血液樣本。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 血液樣本按照Chelex-100法提取DNA。在1.5ml的離心管中加入1ml純凈水，取2μl全血加入，劇烈震蕩后室溫放置30 min。12000轉/分室溫離心3 min，棄上清后收集血細胞沉淀。加200 μl 5%的Chelex-100混合液，劇烈震蕩后瞬時離心，56℃孵育30 min。100℃煮沸8min，13000 轉/分室溫離心3min，上清DNA保存于4℃備用。

1.2.2 PCR擴增 取DNA 1μl，按照Powerplex21體系(美國Promega公司)的說明書進行20個常染色體和1個性染色體STR基因座的PCR復合擴增。

1.2.3 STR基因座的等位基因分型 取PCR擴增產物1μl，每個孔加入8.5μl甲酰胺及0.5μl分子量內標，同時設置allelic ladder、陰陽性對照孔，充分混合后瞬時離心，95℃變性3 min后迅速置于冰上冷卻5 min。用3500XL基因分析儀(美國AB公司)進行毛細管電泳，使用GeneMapperID-X軟件分析，獲得DNA的STR基因座等位基因分型。

1.2.4 STR基因座OL (off-ladder)稀有等位基因的計算/命名 以ladder作為分型標準，結合OL等位基因的片段大小和漂移率進行計算命名[5]。

2 結果

2.1 Penta D基因座STR基因座OL等位基因分型結果 利用PowerPlex21體系在三聯體親子鑒定案件的父親和孩子中檢測發現Penta D基因座存在OL等位基因(圖1)，父親的等位基因分型為10,OL；孩子的等位基因分型為9,OL；母親的等位基因分型為9。

圖1 Powerplex21體系檢測Penta D基因座OL等位基因分型

2.2 Penta D基因座off-ladder等位基因的分型計算 根據OL等位基因的大小，結合基因分型標準物(allelic ladder)等位基因的大小，計算基因座的漂移率，進而計算OL等位基因的大小后進行分型命名。

3 討論

親權鑒定的實踐和研究中，不同STR基因座的off-ladder等位基因現象國內外有報道，例如D13S317、D19S433、D21S11、D16S539、D3S1358、TPOX、THO1、D7S820和FGA基因座等[5，6]。OL等位基因一般分為兩種類型：一種是超出了該基因座基因分型標準物(allelic ladder)的范圍，在范圍之外；另外一種是沒有超出基因座的allelic ladder范圍，在兩個等位基因之間[7]。Powerplex21體系是由Promega公司研發生產的遺傳學檢測系統，廣泛應用于人群遺傳多態性和法醫物證檢測研究，能夠同時檢測20 個常染色體和1個性染色體STR基因座，但在國內沒有應用該系統進行廣東地區漢族人群Penta D基因座OL稀有等位基因的研究報道。本文發現的OL等位基因超出了Powerplex21體系中Penta D基因座Allelic Ladder的最大范圍17，屬于第一種類型。Penta D基因座位于人類21號染色體短臂(21q22.3)，是核心序列為5堿基(AAAGA)的重復序列，Powerplex21體系中采用JOE熒光標記，基因分型標準物(Allelic Ladder)的片段長度范圍為377～450bp，Penta D基因座的等位基因分型標準物中核心序列重復次數范圍為 2.2、3.2、5-17。該基因座的遺傳多態性較高，有文獻報道在Penta D基因座發現OL和稀有等位基因11.2、18、19等[8]，這些OL等位基因對于提高該基因座的個體識別能力具有重要意義。

遇到STR基因座出現OL等位基因時，根據Allelic Ladder的分型標準和漂移率計算命名，OL等位基因計算命名一般有兩種情況：過濾漂移率之后，如果OL峰的片段長度變化是Allelic Ladder相對應峰的整數倍(X倍)，則計算為Allelic Ladder相對應峰大小±X；如果OL峰的片段長度變化不是Allelic Ladder相對應峰的整數倍，只是增加或者減少幾個堿基(bp)，著計算為Allelic Ladder相對應峰大小.X(X為相差的堿基數)(例如相差1個堿基或者2個堿基分別為10.1、10.2)。本研究中，孩子Penta D基因座的OL等位基因，過濾掉漂移率(-0.09 bp)之后，OL等位基因(470.37 bp)比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17(450.27 bp)大20.19 bp，而Penta D基因座為五核苷酸的重復，即OL等位基因比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17大約4個重復序列(20.19/5=4.038≈4)，因此，OL等位基因命名為21(圖2)。

父親Penta D基因座的OL等位基因，過濾掉漂移率(0.03 bp)之后，OL等位基因(470.47 bp)比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17(450.27 bp)大20.17 bp，而Penta D基因座為五核苷酸的重復，即OL等位基因比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17大約4個重復序列(20.17/5=4.034≈4)，因此，OL等位基因命名為21(圖2)。本研究在廣東地區漢族人群中發現Penta D基因座存在OL等位基因21，該等位基因同時屬于稀有等位基因，而且孩子與父親同時存在OL等位基因，即孩子的OL等位基因21是來源于父親的遺傳，這種在親代和子代中遺傳的稀有等位基因發生頻率非常低，在人群中的頻率很小，因此，會對親子鑒定中父權指數(PI)值和累積父權指數(CPI)值計算有很大的影響，進而影響親子鑒定的鑒定結論。鑒于OL稀有等位基因非常小的人群頻率，在計算OL基因座的父權指數時可以考慮使用該STR基因座的最小等位基因頻率。本研究發現的OL稀有等位基因，可以作為Powerplex21體系中Allelic Ladder等位基因的補充，對于提高該檢測體系及Penta D基因座的檢測效能提供一定的應用價值。

圖2 Penta D基因座OL等位基因大小