小鼠急性肝損傷對棕色脂肪組織功能的影響及機制研究

馮 妙，卜浩林，李麗紅，郭林芝，苗宇船，郭建紅*

(1.山西醫科大學病理生理學教研室，太原 030001；2.山西醫科大學形態學實驗室，太原 030001；3.山西中醫藥大學基礎醫學院，山西 晉中 030619)

嚙齒動物體內的脂肪組織分為白色、米色和棕色脂肪組織，三種脂肪組織相互協同以確保嚙齒動物維持最佳代謝狀態，當它們出現功能失調時，就會導致胰島素抵抗和相關的代謝并發癥，從而損害機體代謝穩態[1]。白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)是一種儲能組織，能快速動員以提供其他組織的能量需求；米色和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)是一種耗能組織，通過其線粒體上解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)的作用，使能量以熱量的形式釋放[2]。很多證據表明棕色脂肪組織的移植或活化逆轉了肥胖并改善了胰島素敏感性[3-4]，因此，棕色脂肪組織是治療代謝綜合征的潛在目標[5]。

肝是新陳代謝的主要器官，它執行全身代謝穩態所需的多種生化功能，尤其在脂質代謝中起著重要作用。肝吸收血清中的游離脂肪酸、合成和輸出脂質和脂蛋白。在肝細胞中，游離脂肪酸可以通過β氧化生成ATP；也可以酯化生成甘油三酯，這些甘油三酯以極低密度脂蛋白的形式釋放到血液中，運輸至脂肪組織儲存[6-7]。作為全身代謝的主要參與者，肝與脂肪組織緊密相連，肝通過調節代謝產物影響脂質的儲存和代謝；另外，肝源性調節分子也會影響脂肪組織的炎癥和胰島素抵抗[8]，然而肝對棕色脂肪組織功能的影響尚不明確。本研究通過用25% CCl4制備小鼠急性肝損傷模型，在不同時間點觀察棕色脂肪組織的變化，探討急性肝損傷對棕色脂肪組織功能的影響及相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡C57BL/6雄性小鼠18只，體重19.5～20.5 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供[SCXK(湘)2014-0011]。所有動物在本實驗室獨立動物房飼養[SYXK(晉)2015-0001]，室溫(22±1)℃，12 h光照/12 h黑暗循環，自由獲取食物和水。動物的使用及操作按照本校動物管理委員會(IACUC2017-001)的規定執行，在使用動物的過程中充分考慮動物福利3R原則，最大程度減少對動物的傷害和痛苦。

1.2 主要試劑與儀器

CCl4(天津市風船化學試劑科技有限公司，中國)；RNAiso Plus(寶日醫生物技術有限公司，9108/9109，中國)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(寶日醫生物技術有限公司，RR047A，中國)；TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(寶日醫生物技術有限公司，RR820A，中國)；UCP1抗體(Abcam公司，ab10983，英國)；聚合HRP標記抗兔/鼠IgG(BOSTER，SVOOO4，中國)；DAB顯色液(索萊寶生物科技有限公司，20190307，中國)；Ucp1引物、β-actin引物(華大基因，中國)；AST ELISA試劑盒(江萊生物，JL13939，中國)；ALT ELISA試劑盒(江萊生物，JL13983，中國)；TNF-α ELISA試劑盒(江萊生物，JL10484，中國)；酶標儀(伯騰儀器有限公司，SpectraMAX190，美國)；離心機(eppendorf公司，eppendorf 5804R，德國)；實時定量PCR反應儀(杭州博日科技有限公司，FQD-96a，中國)；包埋機(Leica公司，Leica EG 1150 H，德國)；光學顯微照相系統(奧林巴斯株式會社，Olympus IX71，日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與處理

將18只8周齡C57BL/6雄性小鼠隨機分為對照組(n＝6)、CCl42周組(n＝6)和CCl44周組(n＝6)。CCl4和橄欖油根據體積比配置成25% CCl4溶液。CCl4組腹腔注射(ip)25% CCl4，劑量為每3 d 0.1 mL/10 g，共2次；對照組給予同等劑量的橄欖油。所有小鼠飼以普通飼料和飲用水。分別在2周末和4周末經1%戊巴比妥鈉麻醉各組小鼠后心臟采血，取肝和棕色脂肪組織，稱重棕色脂肪組織。

1.3.2 HE染色

取部分肝和棕色脂肪組織置于10%福爾馬林溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片(切片厚度為4μm)，行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.3.3 免疫組織化學

棕色脂肪組織石蠟包埋切片(切片厚度為4 μm)，切片常規脫蠟至水，微波爐中高溫進行抗原修復，3% H2O2溶液孵育10 min以消除內源性過氧化物酶，5%BSA溶液37℃封閉30 min，一抗孵育(UCP1抗體濃度為1∶500)，4℃過夜，次日滴加聚合HRP標記抗兔/小鼠IgG，37℃孵育30 min，DAB顯色適當時間(顯微鏡下出現陽性顆粒)，蘇木素復染30 s，中性樹膠封片。

1.3.4 實時定量PCR

取部分棕色脂肪組織，用液氮充分研磨，根據試劑盒說明書，使用RNAiso Plus試劑提取棕色脂肪組織中的總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒對總RNA進行逆轉錄。使用TB Green ? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行實時定量PCR。引物由華大基因合成。小鼠β-actin引物序列為F:5’-AGCCATGTACGTA GCCATCC-3’，R:5’-GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA-3’；Ucp1引物序列為F:5’-ACTGCCACACCT CCAGTCATt-3’，R:5’-CTTTGCCTCACTCAGGA TTGG-3’。實時定量PCR的反應條件:95℃預變性30 s，1個循環；95℃變性5 s，40個循環；60℃退火30 s，40個循環。以β-actin作為內參，基因差異表達水平用2-ΔΔCt方法計算:△△Ct＝(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.3.5 ELISA

將收集的全血室溫靜置片刻，4℃下以3000 r/min離心10 min，收集上層血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中AST、ALT和TNF-α的含量。

1.3.6 圖像采集與分析

使用OLYMPUS光學顯微照相系統進行取圖，使用Image J軟件對組織學結果進行光密度測定，使用GraphPad Prism 5.0軟件繪制所有統計圖表。

1.4 統計學方法

統計數據使用IBM SPSS Statistics 21.0軟件進行分析。數據以平均數±標準誤差(±)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，兩變量間的相關性分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠急性肝損傷2周和4周肝的病理變化

與對照組相比，CCl42周組肝可見明顯的細胞壞死、核溶解，肝細胞排列紊亂、肝竇擴張，大量炎性細胞浸潤(圖1A、1B)；與CCl42周組相比，CCl44周組肝可見少量肝細胞壞死和炎性浸潤(圖1B、1C)。

2.2 小鼠急性肝損傷2周和4周血清中ALT、AST的含量

與對照組相比，CCl42周組血清中ALT含量增加(圖2A，P＜0.01)，AST含量增加(圖2B，P＜0.01)；與CCl42周組相比，CCl44周組血清中ALT含量減少(圖2A，P＜0.05)，AST含量減少(圖2B，P＜0.05)。

2.3 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織的重量

與對照組相比，CCl42周組棕色脂肪組織重量減少(圖3，P＜0.05)；與CCl42周組相比，CCl44周組棕色脂肪組織重量增加(圖3，P＜0.05)。

2.4 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織的病理變化

與對照組相比，CCl42周組棕色脂肪組織脂滴增大，空泡增多(圖4A、4B)；與CCl42周組相比，CCl44周組棕色脂肪組織脂滴減小，但仍可見少量較大的脂滴(圖4B、4C)。

注:A:對照組；B:CCl4 2周組；C:CCl4 4周組。圖1 小鼠急性肝損傷2周和4周肝的病理變化(HE染色)Note.A，Control group.B，CCl4 2-week group.C，CCl4 4-week group.Figure 1 Pathological changes in the liver of mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks(HE staining)

注:與對照組相比，**P＜0.01；與CCl4 2周組相比，＃P＜0.05。圖2 小鼠急性肝損傷2周和4周血清中ALT、AST的含量Note.Compared with the control group，**P＜0.01.Compared with the CCl4 2-week group，＃P＜0.05.Figure 2 Serum content of ALT and AST in mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

注:與對照組相比，*P＜0.05；與CCl4 2周相比，＃P＜0.05。圖3 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織的重量Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the CCl4 2-week group，＃P＜0.05.Figure 3 Weight of brown a dipose tissue in mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

2.5 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織UCP1的表達

用免疫組化方法檢測棕色脂肪組織特異性蛋白UCP1的變化，與對照組相比，CCl42周組UCP1蛋白表達量減少(圖5A、5B、5D，P＜0.05)；與CCl42周組相比，CCl44周組UCP1蛋白表達量增加不明顯(圖5B、5C、5D，P＞0.05)。

2.6 小鼠急性肝損傷2周和4周小鼠棕色脂肪組織Ucp1 mRNA的水平

與對照組相比，CCl42周組Ucp1 mRNA表達量減少(圖6，P＜0.05)；與CCl42周組相比，CCl44周組Ucp1 mRNA表達量增加(圖6，P＜0.01)。

2.7 小鼠急性肝損傷2周和4周血清中TNF-α的含量

用ELISA法檢測血清中TNF-α的含量，與對照組相比，CCl42周組血清中TNF-α含量增加(圖7，P＜0.001)；與CCl42周組相比，CCl44周組血清中TNF-α含量減少(圖7，P＜0.001)。

注:A:對照組；B:CCl4 2周組；C:CCl4 4周組。圖4 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織的病理變化(HE染色)Note.A，Control group.B，CCl4 2-week group.C，CCl4 4-week group.Figure 4 Pathological changes in brown adipose tissue in mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks(HE staining)

注:A:對照組；B:CCl4 2周組；C:CCl4 4周組；D:光密度均值。與對照組相比，*P＜0.05。圖5 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織UCP1的免疫組化結果Note.A，Control group.B，CCl4 2-week group.C，CCl4 4-week group.D，Mean optical density value.Compared with the control group，*P＜0.05.Figure 5 Immunohistochemical results of UCP1 in brown adipose tissue of mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

2.8 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平與血清TNF-α含量的相關性分析

使用Pearson法來檢驗棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平與血清TNF-α含量之間的關系，CCl42周組棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平與血清TNFα含量呈顯著負相關(表1，P＜0.01)；CCl44周組棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平與血清TNF-α含量呈顯著負相關(表2，P＜0.05)。

表1 CCl4 2周組棕色脂肪組織Ucp1 mRNA與血清TNF-α的相關性Table 1 Correlation between Ucp1 mRNA in brown adipose tissue and serum TNF-αin the CCl4 2-week group

注:與對照組相比，*P＜0.05；與CCl4 2周組相比，＃＃P＜0.01。圖6 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織Ucp1 mRNA的水平Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the CCl4 2-week group，＃＃P＜0.01.Figure 6 Ucp1 mRNA level in brown adipose tissue of mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

注:與對照組相比，***P＜0.001；與CCl4 2周相比，＃＃＃P＜0.001。圖7 小鼠急性肝損傷2周和4周血清中TNF-α的含量Note.Compared with the control group，***P＜0.001.Compared with the CCl4 2-week group，＃＃＃P＜0.001.Figure 7 Serum content of TNF-αin mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

表2 CCl4 4周組棕色脂肪組織Ucp1 mRNA與血清TNF-α的相關性Table 2 Correlation between Ucp1 mRNA in brown adipose tissue and serum TNF-αin the CCl4 4-week group

3 討論

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)目前已成為一個全球性問題，它是一組復雜的代謝紊亂癥候群，其臨床表現包括中心性肥胖、糖耐量異常、高血壓、血脂代謝紊亂[9]。脂肪組織與代謝綜合征的發生、發展密切相關[10]，眾所周知，內臟白色脂肪積聚是引起代謝綜合征的關鍵因素[11-12]。而自從在成年人體內發現棕色脂肪組織以來，棕色脂肪組織由于其在能量代謝中的作用而備受關注[13]，與白色脂肪組織儲存能量不同，棕色脂肪組織通過UCP1產生熱量[14]。因此，棕色脂肪組織被認為是治療肥胖癥和代謝綜合征的新潛在靶標[4]。肝在脂質代謝中起著重要作用[6-7]，然而目前肝對棕色脂肪組織功能的影響知之甚少，本研究通過用CCl4制備急性肝損傷模型，觀察棕色脂肪組織功能的變化。

在本實驗中，我們分離的棕色脂肪組織為肩胛間棕色脂肪組織，它被認為是經典的棕色脂肪庫[15-16]。CCl4是誘導急性肝損傷模型的經典藥物[17]，它主要的靶器官是肝，不會對其它器官造成明顯的損害[18]，因此在本實驗中我們可以排除CCl4對棕色脂肪組織的直接影響。此小鼠模型表現為肝功能障礙，包括炎性細胞浸潤和肝細胞壞死[19]。此外，急性肝損傷還伴有肝酶的升高，谷草轉氨酶(AST)主要分布于肝細胞的線粒體和細胞質中，谷丙轉氨酶(ALT)主要分布于肝細胞的細胞質中，當急性肝損傷導致細胞膜通透性增加時，ALT、AST就會大量釋放到血液中，因此血清中ALT、AST升高被認為是判斷急性肝損傷嚴重程度的重要指標[20]?；诒菊n題組造模的經驗，選用25% CCl4制備急性肝損傷模型，在2周和4周動態觀察肝和棕色脂肪組織的變化。

本研究結果顯示在急性肝損傷2周時觀察到肝損傷較嚴重，血清中ALT、AST含量明顯增多，棕色脂肪組織重量減少，脂滴增大，4周時肝損傷程度減輕，血清ALT、AST含量減少，棕色脂肪組織重量增加，脂滴減??；提示小鼠肝功能障礙可降低棕色脂肪組織的活化能力，使機體產熱減少。我們進一步檢測了棕色脂肪組織UCP1的表達，UCP1是棕色脂肪組織線粒體內膜上的特異性蛋白，通過線粒體膜中的質子泄漏來耗散電化學質子梯度，從而導致氧化磷酸化的解偶聯，使能量以熱量的形式釋放[2]，結果顯示2周時UCP1蛋白表達減少，Ucp1 mRNA水平降低，4周時Ucp1 mRNA水平升高，表明肝功能障礙可導致棕色脂肪組織功能下降。此外，考慮到肝本身作為一個產熱器官，急性肝損傷時肝產熱功能也會受到影響，但本研究主要測定的是棕色脂肪組織UCP1的變化，UCP1是表達于棕色脂肪組織的特異性蛋白[2]，以此判斷急性肝損傷對棕色脂肪組織產熱能力的影響。

有研究表明腹腔注射重組TNF-α蛋白能抑制小鼠白色和棕色脂肪組織中的UCP1[21]。另外，Chen等[22-23]研究發現急性肝損傷后肝枯否細胞(Kupffer cells，KC)被激活，釋放促炎因子TNF-α，進一步加重肝的損傷。因此，我們檢測了血清中TNFα的含量，結果顯示肝損傷2周時血清中TNF-α含量增加，4周時下降，提示棕色脂肪組織UCP1的表達與血清TNF-α含量的變化有關。為了進一步表明它們之間的關系，通過Pearson法檢驗棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平和血清TNF-α含量之間的相關性，結果顯示2周和4周時棕色脂肪組織Ucp1 mRNA和血清TNF-α均呈現顯著負相關，提示在小鼠急性肝損傷2周時，激活的肝枯否細胞分泌促炎因子TNF-α到血清中，抑制棕色脂肪組織UCP1的表達；而在4周時，肝恢復部分功能，血清中TNF-α水平下降，棕色脂肪組織Ucp1 mRNA表達增加。而UCP1蛋白表達增加不明顯，可能原因是基因水平的變化提前于蛋白水平的變化。

綜上所述，在小鼠急性肝損傷后，棕色脂肪組織重量減少、脂滴增大、特異性蛋白UCP1表達減少、活化能力降低，提示肝功能障礙可導致棕色脂肪組織功能下降，機體產熱減少，從而影響代謝穩態，機制可能與TNF-α含量升高有關。