丹江口水庫上下游古菌優勢菌群落結構特征分析

林亞萱 黨晨原 鐘思寧 王佳文 鄭彤 倪晉仁

丹江口水庫上下游古菌優勢菌群落結構特征分析

林亞萱 黨晨原 鐘思寧 王佳文 鄭彤 倪晉仁?

教育部水沙科學重點實驗室, 北京大學環境工程系, 北京 100871; ?通信作者, E-mail:nijinren@iee.pku.edu.cn

采用 16S rRNA Illumina Miseq 高通量測序技術, 分析丹江口水庫庫區及漢江下游古菌物種組成, 并對大壩上、下游水體與沉積物中占優勢的氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea, AOA)和產甲烷古菌(Methanogenic archaea)群落結構進行分析。結果表明, 優勢種群落結構組成受到水體與沉積物樣本差異的影響, 可由氨氧化古菌的好氧特性與產甲烷古菌的厭氧特性合理地解釋。網絡圖分析表明, 丹江口水庫上游氨氧化古菌與產甲烷古菌具有顯著的相關關系。受丹江口水庫運行的影響, 大壩下游水體及沉積物中氨氧化古菌豐度皆比大壩上游少, 而沉積物中產甲烷古菌豐度較高, 二者間相關性不明顯。

大壩; 氨氧化古菌; 產甲烷古菌; 高通量測序

河流是重要的生態系統, 在生態平衡和人類生活中起著至關重要的作用[1]。河流是地球陸地表面因流水作用而形成的典型地貌類型[2], 具有泄洪、供水、自凈、航運、發電和景觀等多種功能[3]。河流中含有豐富的微生物, 它們是生物地球化學過程(如氮、硫和碳循環)的關鍵參與者, 是各生態系統的主要生產者和消費者[4], 對水質有重要的影響[5]。為了實現水資源優化配置, 利用水庫可以實現蓄水、防洪和發電等諸多功能, 但也會導致河流生境和生物的變化[6]。

漢江是長江最大的支流, 水利資源豐富[7]。漢江上游山谷具有天然的地勢落差, 丹江口水庫的建設使庫區水位上升, 由于周邊土壤被淹沒, 導致土壤中養分進入水體, 水中氮和磷的含量增加[8]。前人的研究表明, 大壩對生境以及細菌、魚類等群落結構和多樣性造成影響[9–10]。Reyes-Gavilán 等[11]指出, 水壩建設會對魚類群落的遷徙造成影響, 從而影響整體多樣性。Wang 等[12]指出, 大壩會對浮游細菌的生物量和多樣性造成影響。另有研究表明, 大壩會導致沉積物物理化學性質改變, 使得微生物群落結構發生變化[13]。

古菌中的氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archa-ea, AOA)在河流生態系統的氮循環中發揮著重要作用[14]。例如, Zhou等[15]的研究發現, 氨氧化古菌可以適應極端環境, 并在極端環境中對全球氮循環發揮不可或缺的作用。產甲烷古菌(methanogenic ar-chaea)則是介導土壤和河流底泥中甲烷循環的重要功能物種[16], 廣泛分布在海洋沉積物[17]、淡水沉積物[18]、水稻田[19]、濕地[20]、人類和動物的腸道[21]以及厭氧消化器等極端環境。有研究估計, 河流對全球甲烷的貢獻將從每年 1.5Tg CH4升高到 26.8 Tg CH4, 相當于濕地與湖泊甲烷排放量的 15%和40%[22–23]。鑒于氨氧化古菌及產甲烷古菌存在的廣泛性和重要性, 本文選擇漢江代表性河段進行采樣, 重點了解漢江受丹江口水庫建設影響區域的古菌群落與優勢種, 揭示大壩對研究區域古菌優勢種的影響。

1 研究區域與研究方法

1.1 研究區域及樣點布設

漢江全長 1532km, 流域面積有 15.9 萬 km2[24]。根據漢江的國家水文站點分布情況, 設置 6 個采樣點, 從上游到下游分別是白河、陶岔、丹江口壩下、襄陽、仙桃和集家嘴(圖 1), 于 2014 年春季(3月)和秋季(10月)同步采集水樣與沉積物樣本。

1.2 樣品采集與處理

參照中華人民共和國環境保護行業標準 HJ/T- 2002《地表水和污水檢測技術規范》中的等比例混合水樣采集法[25], 將采集的水樣在 24 小時內用孔徑為 0.22μm 的聚碳酸酯膜(Millipore, 美國)進行過濾。過濾水樣的濾膜與沉積物樣本都置于干冰中, 運輸至實驗室, 貯藏在?80oC冰箱中備用。

水樣 DNA 提取使用液氮反復凍融法來裂解細胞, 后續與沉積物樣本一致, 依據 FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, 美國)試劑盒協議步驟進行。

1.3 數據處理與分析

采用 524F10extF/Arch958RmodR[26]引物對 16S rRNA 進行 3 次 PCR 重復擴增。本研究采用 MiSeq高通量測序技術, 以 97% 的相似性閾值進行 OUT 聚類, 后與 Silva 數據庫比對, 獲得 OTU 物種表格。

使用 R 語言軟件(R version 3.5.1)的 pheatmap, vegan, ggplot2 和 igraph程序包, 分別對數據進行熱圖(Heatmap)分析、非度量多維標定 (non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)分析、ANOSIM分析、方差分析和網絡關系(Network)圖分析。其中, NMDS 使用 Bray-Curtis 距離, 方差分析以< 0.05 作為篩選標準。Network 以= 0.85 作為閾值, 做 Spearman 相似性分析, 使用Gephi 作圖。

2 結果與討論

2.1 古菌及優勢種的群落組成

通過 16S rRNA 高通量測序技術, 分析漢江生態系統中古菌群落組成。此次調查共得到 2908 個OTU, reads 數 966898 條。所有樣品共檢測出 21 個門, 相對豐度大于 0.01%的共有 12 個門以及一個未分類微生物, 分別為(奇古菌門, 53.9%)、(廣古菌門, 26%)、(深古菌門, 9.5%)、(0.7%)、(洛基古菌, 0.8%)、(1.1%)、(0.6%)、(0.4%)、(0.3%)、(0.3%)、(0.3%)、(0.3%)及unclassified (5.3%), 如圖 2 所示。奇古菌門和廣古菌門是漢江流域的主要優勢菌門, 數量占有絕對優勢, 但兩者在水樣和泥樣中的相對豐度有顯著區別: 奇古菌門在水體樣品中的相對豐度(超過 50%)都比在沉積物中高(約占 20%); 廣古菌門是漢江流域沉積物中古菌豐度最高的門(43.5% (春泥)和 42.8%(秋泥)), 也是浮游古菌豐度第二高的優勢門(23.5% (春水)和4.7% (秋水))。

奇古菌門中以氨氧化古菌(87.90%)為主, 廣古菌門內物種豐富, 包括產甲烷菌(65.34%)、甲烷氧化菌(7.64%)與嗜鹽菌(0.02%)等, 由此得出氨氧化古菌是奇古菌門的優勢種, 產甲烷菌是廣古菌門的優勢種的結論。漢江中的優勢功能物種是氨氧化古菌和產甲烷古菌, 二者分別在漢江的水體與沉積物中起重要作用。發現的氨氧化古菌共有 4 種屬, 分別是(),(),()和(), 其中在氨氧化古菌中相對豐度最高。產甲烷古菌中是屬屬和屬的相對豐度最高。屬和屬是已知產甲烷古菌中僅有的兩種可以使用乙酸作為底物的屬[27]。研究表明, 在淡水環境中是乙酸型的產甲烷古菌占主導, 其中乙酸型和氫營養產甲烷古菌分別占 CH4產量的 70%和 30%[28–29]。

漢江上游的丹江口水壩是南水北調中線工程的調水源頭。圖 3 比較古菌優勢種在丹江口水壩上、下游的相對豐度差異, 其中 4 個區域分別是丹江口水壩上游水體、上游沉積物、下游水體和下游沉積物中古菌的相對豐度, 顏色的深淺代表相對豐度的高低。4 個分組中, 氨氧化古菌的屬、屬綱和綱以及產甲烷古菌的屬、屬和屬都是豐度較高的物種。屬和綱在水體中相對豐度高, 體現氨氧化古菌對好氧環境的偏好。屬與屬則在水體中相對豐度較低, 在沉積物中相對豐度較高, 顯示產甲烷古菌的厭氧特性。

本研究中, 浮游古菌以好氧的氨氧化古菌為主, 沉積物古菌則以厭氧的產甲烷古菌為主, 這種現象可由氨氧化古菌的好氧特性與產甲烷古菌的厭氧特性來合理的解釋。雖然在水體與沉積物中也分別發現產甲烷古菌與氨氧化古菌, 但這是由于氨氧化古菌可以在低氧環境中生存[15]。另一方面, 產甲烷古菌也在好氧環境中被發現[30–32], 但有氧環境對產甲烷有抑制作用。

分別篩選出壩上與壩下水體和沉積物中具有顯著性差異的優勢物種(<0.05)。圖 4 顯示, 水庫下游浮游氨氧化古菌的豐度略少于上游, 而產甲烷古菌的豐度在上、下游的差別不顯著(尤其是屬和屬)。圖 5 顯示, 沉積物中氨氧化古菌的豐度在丹江口水壩下游減少, 表明沉積物中氨氧化古菌受到水壩運行的影響, 而產甲烷古菌的豐度在下游比上游有明顯的提升, 可能與上、下游沉積物中有機質含量的差異有關。

2.2 古菌優勢種群落結構空間分布

采用 NMDS 分析法, 分別分析大壩上、下游兩個優勢菌群落結構的時空格局(圖 6)。壩上與壩下的氨氧化古菌群落組成在沉積物與水體間有差異, 沉積物中的物種形成一個明顯的區塊, 浮游物種相對分散, 但也形成一個區塊, 表明漢江流域的氨氧化古菌群落結構組成受到水體和沉積物樣本差異的影響。產甲烷古菌與氨氧化古菌的分析結果一致, 產甲烷古菌的群落結構組成在壩上與壩下都受到樣品差異的影響。

為驗證結果的可靠性, 對 NMDS 分析結果進行相似性分析(圖 7)。壩上氨氧化古菌的值為 0.5,值為 0.01; 壩下值為 0.5643,值為 0.001。壩上產甲烷古菌的值為 0.3056,值為 0.04; 壩下值為 0.3047,值為 0.007。值表示結果具有統計學意義, 表明優勢種在丹江口水庫上、下游的樣品差異分組具有意義, 顯示氨氧化古菌和產甲烷古菌都受到水體與沉積物樣品差異的影響。

對古菌優勢種的時空格局分析結果表明, 雖然丹江口水庫在一定程度上影響古菌優勢種在上、下游的相對豐度, 但并未顯著地影響古菌群落結構, 表明古菌對不同環境具有更廣泛的適應性。溫度、pH和氧氣濃度等的變化是導致水體與沉積物中優勢種群落結構變化的關鍵因素, 例如,屬和屬常在海洋與河口沉積物中被發現[33],屬偏好酸性土壤,屬則主要在陸地土壤中被發現[34]。產甲烷古菌內部物種同樣對環境有不同的需求, 如甲烷屬要求乙酸濃度高的生存環境,屬則可在乙酸濃度偏低的環境中生存[35]。產甲烷菌根據對溫度的要求不同, 可分為嗜熱菌(55~80°C 左右)、嗜溫菌(35°C 左右)以及嗜冷菌(低于 25°C)。例如, 研究表明低溫條件下產甲烷古菌以乙酸型的屬占主導[36], 嗜冷菌的屬物種不能在超過 20°C的地方生長[37]。

圖5 沉積物中優勢物種在大壩上游與下游的豐度

2.3 古菌優勢種之間的關系

通過網絡關系圖(圖 8), 分析氨氧化古菌與產甲烷古菌在大壩上、下游物種之間的關系。丹江口水壩上游優勢物種共生網絡的節點中, 氨氧化古菌和產甲烷古菌分別占 44.44%和 55.56%, 兩者之間的關系以正相關為主。上游優勢物種的共生網絡(圖 8(a))可以分為 3 個部分: 氨氧化古菌的獨立部分、產甲烷古菌獨立部分以及兩者相互關聯的部分。兩者相互關聯的部分主要包括 OTU2577, OTU 4187, OTU1436, OTU4358, OTU2748, OTU2799, OTU2545, OTU2543, OTU3255, OTU3089, OTU 3469 和 OTU4227, 分別屬于氨氧化古菌的綱與, 以及產甲烷古菌的,,,,和。

丹江口水壩下游氨氧化古菌與產甲烷古菌的比例分別是 47.22%和 52.78%。兩個優勢種之間的關系以正相關為主, 負相關僅占總體的不到 1%。下游兩個優勢種各自形成獨立的區塊(圖 8(b)), 彼此之間基本上沒有關聯。既屬于上游相互聯系的又在下游相關的 OTU 有 OTU1436, OTU2577, OUT2545, OTU3255, OTU3089 和 OTU4227, 分別屬于氨氧化古菌的綱以及產甲烷古菌的和。

對比丹江口水庫上、下游物種間的關系, 可知丹江口水庫上游氨氧化古菌與產甲烷古菌具有顯著的相關關系, 而下游的相關性并不明顯。黃柳琴等[38]的研究表明, 雖然水庫運行對氨氧化古菌群落結構的影響并不明顯, 但會改變其生存方式, 如在三峽大壩上游的氨氧化古菌以附著為主, 而下游以浮游為主。這與我們的研究結果十分類似, 即壩上游氨氧化古菌與產甲烷古菌關聯密切, 但壩下游因河床的劇烈沖刷大大削弱了二者之間的聯系。

3 結論

本文基于 2014 年春季(4 月)和秋季(10 月)在受丹江口水庫影響的漢江河段監測結果, 對古菌物種組成、群落結構及優勢種的相互關系進行分析, 得到以下主要結論。

1)漢江流域古菌物種的組成由奇古菌門和廣古菌門主導, 水體中以奇古菌門中的氨氧化古菌為主, 沉積物中則以廣古菌門的產甲烷古菌為主, 這可用氨氧化古菌和產甲烷古菌分別適宜好氧和厭氧環境進行很好的解釋。

2)丹江口水庫對氨氧化古菌豐度的影響更主要地表現為對沉積物中古菌的影響。沉積物中產甲烷古菌的豐度在壩下游明顯增高, 可能與上、下游沉積物中有機質含量的差異有關。大壩上、下游氨氧化古菌與產甲烷古菌的群落結構組成受水體與沉積物樣本類型差異的影響更大。

3)網絡圖分析表明, 丹江口水庫上游氨氧化古菌與產甲烷古菌具有顯著的相關性, 但是在大壩下游二者之間未呈現明顯的相關性, 推測與壩下河床沖刷造成物種生存方式的變化有關。

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Community Characteristics of Dominant Archaea before and after the Danjiangkou Dam

LIN Yaxuan,DANG Chenyuan,ZHONG Sining,WANG Jiawen,ZHENG Tong,NI Jinren?

Key Laboratory of Water and Sediment Sciences (MOE), Department of Environmental Engineering, Peking University, Beijing 100871;? Corresponding author, E-mail: nijinren@iee.pku.edu.cn

The 16S rRNA Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to analyze the species composition of archaea in the Danjiangkou reservoir area and the downstream Hanjiang River. The structure of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and methanogenic archaeathat dominated the water and sediments in the upstream and downstream dam was analyzed. The results showed that the structure of the dominant species was affected by the samples difference, which could be explained by the aerobic preference of the ammonia-oxidizing archaea and the anaerobic properties of the methanogenic archaea. According to the network analysis, there was a significant correlation between the ammonia-oxidizing archaea and the methanogenic archaea in the upstream of the Danjiangkou reservoir. Because of the operation of the Danjiangkou reservoir, the abundance of ammonia-oxidizing archaea in the water and sediments of downstream of the dam was reduced, and the abundance of methanogenic archaea in the sediments was relatively high. The relation between them was not obvious.

dam; ammonia-oxidizing archaea; methane-oxidizing archaea; high-throughput sequencing

10.13209/j.0479-8023.2020.034

國家自然科學基金(51539001)資助

2019–04–18;

2019–06–25