腹腔注射右旋糖酐鐵對大鼠嗅球、黑質和紋狀體區DAT蛋白表達的影響

溫曉鳴 謝俊霞 宋寧

[摘要] 目的 研究腹腔注射右旋糖酐鐵對大鼠嗅球、黑質和紋狀體區多巴胺轉運蛋白（DAT）蛋白表達的影響。方法 21 d離乳Wistar大鼠分別腹腔注射右旋糖酐鐵（10 mg/d）和生理鹽水，1周注射3次。1周后取大鼠嗅球、黑質和紋狀體樣本，采用免疫印跡法（Western blot）檢測各腦區DAT蛋白表達情況。結果 與注射生理鹽水組相比，注射右旋糖酐鐵大鼠嗅球中DAT蛋白表達出現顯著降低（t=5.418，P<0.01），而黑質和紋狀體中DAT蛋白表達未發生明顯改變（t=1.719、0.489，P>0.05）。結論 腹腔注射右旋糖酐鐵1周后引起大鼠嗅球中DAT蛋白表達的顯著下降。

[關鍵詞] 鐵右旋糖酐復合物;嗅球;黑質;紋狀體;多巴胺質膜轉運蛋白質類;大鼠，Wistar

[中圖分類號] R338.2 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）02-0150-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.066 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.0915.009.html;2020-04-17 16：04

[ABSTRACT] Objective To explore the effect of intraperitoneal injection of iron dextran on the expression of dopamine transporter （DAT） protein in the olfactory bulb， substantia nigra， and striatum of rats. ?Methods Weaned Wistar rats aged 21 days were intraperitoneal injected with iron dextran （10 mg/d） or normal saline three times a week. One week later， the olfactory bulb， substantia nigra， and striatum were collected to analyze DAT protein expression in each brain region by immunoblotting （Western blot）. ?Results Compared with the saline group， the rats injected with iron dextran had significantly reduced expression of DAT protein in the olfactory bulb （t=5.418，P<0.01）， while the expression of DAT protein in the substantia nigra and striatum did not change significantly （t=1.719，0.489;P>0.05）. ?Conclusion Intraperitoneal injection of iron dextran for one week can significantly decrease the expression of DAT protein in the olfactory bulb of rats.

[KEY WORDS] iron-dextran complex; olfactory bulb; substantia nigra; corpus striatum; dopamine plasma membrane transport proteins; rats， Wistar

帕金森?。≒D）是一種常見的神經退行性疾病，其主要病理特征之一是黑質-紋狀體系統多巴胺能神經元的進行性退變，紋狀體多巴胺含量減少，導致機體運動功能障礙[1]。酪氨酸在酪氨酸羥化酶的作用下生成左旋多巴，之后又通過芳香族氨基酸脫羧酶的作用生成多巴胺。多巴胺可以通過囊泡釋放到突觸間隙，作用于相應的受體，突觸間隙中的多巴胺也可以經多巴胺轉運蛋白（DAT）被重新攝取到突觸前神經元[2-4]，從而維持多巴胺水平在突觸間隙處于一種穩定狀態。DAT介導的多巴胺重攝取可以增加細胞質中多巴胺的含量進而可能導致細胞損傷[5-6]。研究表明，在PD病人和PD動物模型中都有黑質致密區鐵的選擇性沉積[7-8]。大鼠腹腔注射右旋糖酐鐵可以導致鐵在黑質致密區的選擇性沉積[9-10]。本研究的主要目的是在大鼠腹腔注射右旋糖酐鐵1周后觀察嗅球、黑質和紋狀體中DAT蛋白表達的變化。

1 材料和方法

1.1 動物分組與處理

SPF級21 d離乳Wistar大鼠20只，購于北京維通利華公司，飼養于室溫（21±2）℃、濕度（50±5）%、12 h/12 h晝夜循環光照環境下，可自由飲食。注射用右旋糖酐鐵購自Sigma公司。本實驗將大鼠隨機分為注射生理鹽水組（A組）和注射右旋糖酐鐵組（B組），每組10只，分別注射生理鹽水和右旋糖酐鐵（10 mg/d），1周注射3次。

1.2 大鼠腦區樣本提取

大鼠腹腔注射右旋糖酐鐵或生理鹽水1周后，斷頭取嗅球、黑質和紋狀體樣本，稱量嗅球、黑質和紋狀體樣本凈質量。

1.3 免疫印跡法（Western blot）檢測DAT蛋白的表達

按照樣本質量分別加入一定量的蛋白裂解液，充分超聲研磨，以12 000 r/min離心25 min，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入Loading buffer后95 ℃水浴5 min，之后將蛋白樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并濕轉到PVDF膜上，使用50 g/L的脫脂奶粉溶液室溫搖床孵育2 h，用DAT（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗4 ℃孵育過夜，再用山羊抗兔HRP-IgG （1∶10 000）二抗室溫孵育1 h，利用ECL化學發光試劑顯影。應用Image J軟件進行條帶灰度分析，目的蛋白的表達水平以目的蛋白與內參蛋白β-actin條帶灰度值的比值來表示。

1.4 統計學分析

采用Prism 6軟件進行數據的統計分析，所得計量資料數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 ?果

與注射生理鹽水組相比，注射右旋糖酐鐵組大鼠嗅球中DAT蛋白表達出現顯著降低（t=5.418，P<0.01），而黑質和紋狀體中DAT蛋白表達未發生明顯改變（t=1.719、0.489，P>0.05）。見表1。

3 討 ?論

PD作為一種多發于中老年人群的神經退行性疾病，其主要發病因素包括遺傳因素、環境因素、年齡等[1，11]。PD病人腦內紋狀體多巴胺含量下降是其發病的重要原因。多巴胺作為一種神經遞質，一方面可以通過囊泡釋放到突觸間隙作用于相應的受體，一方面本身易被氧化，可以與細胞內的鐵作用生成有害物質，例如6-羥基多巴胺（6-OHDA）[5-6，12]。DAT介導的多巴胺重攝取可維持多巴胺水平在突觸間隙處于一種穩定狀態。去鐵胺（DFO）是一種鐵螯合劑，可以螯合細胞內的鐵。有研究結果表明，DFO可以通過影響細胞內吞作用和DAT mRNA的穩定性而影響DAT的重吸收作用[13-14]。但是關于鐵對DAT的調節卻鮮有報道，故本研究通過腹腔注射右旋糖酐鐵制備大鼠高鐵模型，探討鐵對DAT蛋白表達的影響。

已有研究表明，PD病人紋狀體囊泡攝取功能障礙可能導致多巴胺能神經元死亡[15]，主要原因可能是囊泡攝取多巴胺的能力下降，導致細胞質中游離多巴胺的水平增加，多巴胺代謝副產物包括羥基自由基等物質可以對細胞造成損傷。DAT將多巴胺攝取至細胞內可能會增加多巴胺能神經元中多巴胺的含量，多巴胺氧化可產生6-OHDA和醌類等有毒物質[5]，從而對多巴胺能神經元造成損傷;同時，DAT還可以將某些有毒物質攝取到細胞中[16]。1-甲基4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）可以被單胺氧化酶催化轉變為1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+），通過DAT進入細胞后可以造成線粒體功能障礙。DAT敲除小鼠可以抵抗MPTP的毒性作用[17]，而DAT過表達小鼠對MPTP的毒性作用更敏感[18]。另外，可卡因及其類似物可以阻止DAT將多巴胺轉運至細胞的過程，安非他命及其類似物可以翻轉DAT轉運多巴胺的過程，將細胞內的多巴胺轉運至突觸間隙[19]，促使突觸間隙的多巴胺含量增加。因此，DAT在多巴胺能神經元損傷的機制中具有非常重要的作用。

有研究結果表明，與正常人相比，PD病人黑質紋狀體系統中突觸前末梢和胞體中DAT表達均出現顯著降低[20]。DAT的活性可以受到某些翻譯后修飾的調節，例如磷酸化、泛素化和糖基化等，這些翻譯后修飾主要影響DAT的轉運動力學和在細胞中的分布，例如蛋白激酶C可以通過磷酸化作用促進DAT的內化[19]，胞外信號調節激酶則可以上調DAT的表達水平和活性[21]。此外，有研究表明，在細胞模型中DFO可以降低DAT蛋白的表達和活性[13-14]。鐵能夠促進多巴胺氧化過程，鐵和多巴胺反應生成的6-OHDA是線粒體復合體Ⅰ和復合體Ⅳ的抑制劑，可以導致線粒體功能障礙，從而減少ATP的產生，最終導致細胞的死亡;6-OHDA的代謝還可以產生過氧化氫，參與Fenton反應生成羥基自由基，導致DNA加合物的合成、脂質過氧化、質膜完整性的丟失以及凋亡等[5]。PD的非運動癥狀包括嗅覺減退，嗅覺減退出現的時間比運動癥狀出現的時間更早。有研究結果表明，在注射MPTP的食蟹猴嗅球中，多巴胺含量增加，而且嗅球多巴胺含量的增加并不依賴于黑質紋狀體多巴胺能神經元的退變[22]，另外也有研究在PD病人嗅球中發現多巴胺能細胞數量的增加[23]，這可能是由于其他神經遞質系統早期損傷所產生的代償導致的。在本研究中，注射右旋糖酐鐵大鼠嗅球中DAT蛋白表達水平出現明顯降低，但是黑質和紋狀體中DAT蛋白表達水平并未出現明顯改變，其確切的機制還需要進一步研究探討。

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（本文編輯 馬偉平）