腫瘤抑制因子miR-99a對口腔鱗狀細胞癌細胞遷移、增殖和凋亡的影響

梁源 張珊 (漯河醫學高等?？茖W校，河南 漯河 46000；漯河醫學高等?？茖W校第二附屬醫院)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)約占口腔癌病的90%〔1，2〕。盡管手術，化學療法和放射療法等治療方法對病人的病情有所改善，但OSCC患者的總體預后仍然不能令人滿意〔3〕。一些沉默的腫瘤抑制基因在OSCC的進展中起關鍵作用。因此，理解異常腫瘤抑制基因表達機制對于建立新的治療策略，甚至是改善OSCC的預后至關重要〔4〕。研究證實，大多數基因組被轉錄為非編碼RNA，包括microRNA(miR)〔5〕。miRNA是進化上保守的單鏈RNA，由21～24個核苷酸組成。miRNA可以通過靶向mRNA的3′-非翻譯區(UTR)來觸發信使RNA(mRNA)降解或翻譯抑制〔6〕。研究表明，miR與各種癌癥的發生發展和預后有關〔7〕。miR可能在OSCC中失調〔8〕。例如，與鄰近的正常組織相比，miR-15a在腎細胞癌組織中顯著下調〔9〕。報道，包括miR-21、miR-31、miR-155、miR-26b、miR-107和miR-99家族在內的幾種miR在口腔癌中起致癌基因或腫瘤抑制基因的作用〔10〕。miR-99a是口腔癌細胞中下調最多的miR。miR-99a是miR-99家族的成員，由染色體21q處的C21orf34基因的內含子13編碼。與實體瘤中染色體21q的頻繁丟失一致。在幾種癌癥類型中檢測到miR-99a表達的減少。包括前列腺癌，肝癌，膀胱癌和口腔癌等〔11〕。這些研究顯示了miR-99a的表達可以通過靶向3′UTR降低了一些原癌基因的表達，表明miR-99a具有腫瘤抑制作用。本研究擬探討miR-99a在OSCC中的表達和生物學功能。

1 材料和方法

1.1材料 人OSCC細胞系(SCC6，SCC9，SCC25和HN4)和正常人口腔角質形成細胞(HOK)由實驗室常規保存。所有的細胞在RPMI1640或者DMEM培養基中培養。除此之外，細胞培養時補充5%胎牛血清，1%抗生素(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2RNA提取和逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 為了定量OSCC細胞系中的miR-99a mRNA表達，使用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA，在使用NanoDrop2000c測量RNA濃度后，并使用TaqMan MultiScribe Reverse Transcriptase合成互補DNA(cDNA)，進行qPCR。使用ABI Prism 7900-HT序列檢測系統(96孔，Applied Biosystems)進行qRT-PCR分析。miR-99a的正向引物為5′-CTCGAGCATCCTTAGAACTCAGC-3′，反向引物為5′-CTGCCTTGTAAGACAGAC-3′。U6為內參，正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用2-ΔΔCt方法分析細胞中miR-99a的表達水平。循環條件如為95℃ 2 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s和72℃ 30 s，40個循環。

1.3細胞轉染 miR mimics可以增強內源miR的調節。轉染miR-99a mimics可以讓HN4和SCC6細胞miR-99a的表達上調，使用Lipofectamine2000轉染，細胞培養使用Opti-MEM培養基。

1.4CCK-8測定細胞增殖 使用CCK-8測定法評估HN4和SCC6細胞的增殖能力。將細胞(5 000個/孔)接種在96孔板中，然后用miR-99a mimics，NC mimics轉染。向每個孔中加入10 μl CCK-8溶液，37℃ 5%CO2的培養箱中避光孵育30 min。將細胞孵育0、24、48和72 h后，使用酶標儀測量450 nm處每個孔的OD值。

1.5細胞劃痕實驗 用于評估HN4和SCC6細胞的遷移能力。在6孔板中每孔中接種1×106個細胞。24 h后用miR-99a mimics，NC mimics轉染細胞。轉染后，將細胞在無血清和抗生素的培養基中于37℃培養24 h。接下來，通過拖動無菌的1 ml移液管末端造成細胞劃痕。使用相機系統在0、12和24 h捕獲劃痕的圖像。

1.6Transwell試驗 通過Transwell測定檢查HN4和SCC6細胞的侵襲能力。使用具有Matrigel的Transwell室評估侵襲能力。轉染后24 h，用DMEM將2×104個細胞加入每個上室中，并向下室中加入補充有10%胎牛血清的DMEM。將細胞在5%CO2培養箱中于37℃孵育48 h。固定下室中的細胞，并在室溫下依次用4%多聚甲醛和結晶紫染色20 min。最后，使用光學顯微鏡觀察腔室底部的細胞。在4個隨機選擇的視野中對細胞進行計數。

1.7細胞凋亡和細胞周期分析 1×106個HN4和SCC6細胞分別接種在6孔板中，miR-99a mimics、NC mimics 轉染細胞，轉染后48 h，收獲細胞，并使用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次。使用100 μl 1×結合緩沖液重懸細胞。加入5 μl膜聯蛋白V-熒光素異硫氰酸酯(FITC)和5 μl碘化丙錠(PI)，室溫下避光染色15 min。最后，在每個管中加入400 μl 1×結合緩沖液后，使用流式細胞儀評估細胞凋亡情況。對于細胞周期分析，收獲1×106個細胞，用70%乙醇固定過夜。然后加入Rnase A(100 μg/ml)、碘化丙錠(50 μg/ml)及含有0.1%Triton X-100的PBS，37℃下染色30 min。通過流式細胞術進行細胞周期分析，FlowJo6.1分析數據。

1.8統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1miR-99a的表達水平在OSCC細胞系中下調 HN4、SCC6、SCC9、SCC25 miR-99a表達水平分別是(2.62±0.31)、(3.42±0.22)、(6.45±0.34)、(7.83±0.42)，OSCC細胞系中miR-99a的表達水平較人正?？谇唤琴|形成細胞HOK(10.83±0.43)顯著下降。推測miR-99a可能在OSCC中充當抑癌基因。轉染后24 h后，與NC組(3.35±0.54)比較，miR-99a組miR-99a表達水平在HN4(99.12±4.13)和SCC6(102.13±6.43)細胞顯著升高。

2.2miR-99a的上調抑制HN4和SCC6細胞的增殖 在轉染后24、48和72 h，miR-99a mimics組HN4和SCC6細胞的增殖顯著低于NC組(P<0.05)。見表1。

2.3miR-99a的上調抑制HN4和SCC6細胞的侵襲 與NC組(NH4：0.87±0.04、SCC6：0.78±0.06)相比，miR-99a mimics組HN4、SCC6細胞的侵襲能力顯著下調(0.52±0.05、0.48±0.03，均P<0.05)。見圖1。

細胞組別0 h24 h48 h72 hHN4NC組0.22±0.050.56±0.040.82±0.050.92±0.06miR-99a mimic組0.23±0.060.42±0.041)0.68±0.061)0.76±0.071)SCC6NC組0.24±0.040.67±0.060.89±0.061.07±0.08miR-99a mimic組0.23±0.030.42±0.061)0.72±0.081)0.82±0.061)

與NC組比較：1)P<0.05；表2同

圖1 Transwell試驗評估miR-99a對HN4和SCC6細胞的侵襲能力(結晶紫染色，×100)

2.4miR-99a的上調抑制HN4和SCC6細胞的遷移 與NC組〔NH4相對遷移距離(0.72±0.03)μm、SCC6(0.69±0.04)μm〕相比，miR-99a mimics組HN4、SCC6細胞的遷移能力顯著下調〔(0.53±0.04)μm、(0.52±0.06)μm，均P<0.05〕，見圖2。

2.5miR-99a的上調誘導HN4和SCC6細胞的凋亡 與NC組〔HN4凋亡率為(4.63±0.32)%、SCC6(2.28±0.38)%〕相比，miR-99a mimics組HN4、SCC6細胞的凋亡率顯著升高〔(9.83±0.42)%、(9.18±0.64)%，均P<0.05〕。見圖3。

2.6miR-99a的上調對HN4細胞周期的影響 miR-99a mimics組HN4細胞在G1 期的百分比明顯高于NC組(P<0.05)，G2 期和S期的百分比明顯低于NC組(P<0.05)。見圖4,見表2。

圖2 培養不同時間細胞劃痕實驗檢測miR-99a對HN4和SCC6細胞的遷移能力(×10)

圖3 流式細胞術檢測miR-99a對HN4和SCC6細胞凋亡的影響

圖4 流式細胞術檢測miR-99a對HN4細胞周期的影響

表2 miR-99a對HN4細胞周期的影響

組別G0/G1期S期G2/MNC組50.41±3.3234.45±2.8115.14±3.57miR-99a mimic組79.95±1.621)10.15±1.831)9.91±2.521)

3 討 論

研究顯示，中國臺灣地區口腔癌發病率驚人增加的原因，除了吸煙和喝酒之外還喜歡食用檳榔〔12〕。盡管癌癥治療和診斷取得了進展，但口腔癌的5年生存率在過去的2～3年中保持不變?？谇话╊A后不良的主要原因是快速局部侵襲和擴散及高復發率。了解口腔癌發生和轉移涉及的機制對克服這種惡性腫瘤非常重要〔13〕。miR在轉錄水平后負責調控基因表達，在腫瘤學中有廣泛研究。由于單個miR可能靶向數百個mRNA，異常的miR表達可能會影響大量的轉錄本，而且會影響癌癥相關的信號通路〔14〕。miR的表達在組織特異性中受到高度調控。此外，miR-mRNA相互作用的組合意味著相同的miR可以具有不同的靶標，并且相同的mRNA可以被不同細胞類型中的不同miR靶向。因此，相同的miR可以參與不同的途徑，對細胞生存、生長和增殖具有不同的影響〔15〕。

miR是重要的轉錄后調節因子，它們參與各種生理和病理過程，包括細胞分化、細胞增殖和腫瘤發生發展過程。miR過度表達時被證明可作為致癌基因，miR下調時被用作腫瘤抑制基因。對于miR-99a有很多相關研究，在肺癌中，miR-99a下調導致哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和成纖維細胞生長因子受體(FGFR)3的上調，并促進腫瘤生長和存活〔16〕。MiR-99a通過抑制mTOR和染色質重塑因子(SMARCA)5和SMARCD1抑制前列腺特異性抗原產生和前列腺細胞增殖〔17〕。下調miR-99a表達與肝細胞癌患者的不良預后有關，并且異常miR-99a表達通過靶向IGF1受體(IGF1R)和mTOR來抑制肝細胞生長〔11〕。miR-99a mimics的轉染降低了頭頸癌細胞中mTOR和IGF1R的表達。通過生物信息學預測和使用微陣列分析的實驗驗證，確定IGF1R和mTOR是miR-99a的直接靶標〔18〕。但也有研究證實自噬調節因子(MTMR)3是一種新型的miR-99a靶標〔19〕?？赡躮iR-99a不僅僅只有一個靶標，哪一個靶標是最準確、有效且直接作用于信號通路的需要進一步研究。

腫瘤抑制miR通常在癌細胞中下調〔20～22〕。miR-99a是口腔癌細胞中下調最多的miR〔23〕。下調的miR-99a可以具有腫瘤抑制的功能，miR-99a表達減少口腔癌細胞的遷移和侵襲，抑制了口腔癌細胞的增殖，促進了口腔癌細胞的凋亡〔24〕?？傊?，miR-99a通過減少細胞遷移和侵襲就表現出具有抗腫瘤的作用〔25〕。miR-99a在臨床口腔癌樣本中是下調的，與本實驗結果一致，所以認為miR-99a在口腔癌中的下調可以用作口腔癌的診斷標志物。