利用液液萃取降低莫西克汀雜質含量的研究

何勇崴，岳光

(北大醫藥重慶大新藥業股份有限公司，重慶 400714)

莫西克汀(moxidectin)是一種新型的抗寄生蟲藥(圖1)，是由鏈霉素進行發酵生產，純化后再進行半合成得到的一種，成分單一的大環內酯類物質。CAS號為113507-06-5，分子量為639.83，其外觀為白色或類白色無定形粉末，屬于第三代阿維菌素類藥物[1]。

對牛輻射食道口線蟲(Oesophagostomum radiatum)和Trichurrisdiscolor(未命名)線蟲等第三階段幼蟲的驅殺率達98%。在綿羊體內，耐伊維菌素(Ivermectin，IVM)的捻轉血矛線蟲對莫西克汀敏感[2]。莫西克汀對豬體內的消化道線蟲、肺線蟲和體外寄生蟲都有良好的驅殺效果[3]。

莫西克汀和其它大環內酯類驅蟲藥的不同之處在于，它是單一成分，有著更高的驅蟲活性和長效、安全等特性，且極低劑量下就有很強的抗線蟲和節肢動物等體外寄生蟲活性[4]，目前生產廠商有美國諾華公司和日本三共公司。

圖1 莫西克汀

目前生產上對于莫西克汀純化工藝，除了少數使用高壓制備柱分離外，主要還是采用樹脂或者硅膠為填料的常壓/低壓柱層析[5-6]。在進行色譜分離的時候對收率、純度影響最大的三個雜質為A、E、F雜質(圖2)。歐洲藥典9.0版對其成品中的含量要求為，HPLC檢測A雜質含量≤1.5%，E+F雜質含量≤1.7%[7]。但是我們在實驗中意外的發現，在兩種不相溶的溶劑同時存在的時候，溶劑中莫西克汀和那3個雜質之間的組分比例發生了很大的變化，可以嘗試利用雜質和莫西克汀在溶劑中分配系數的不同來進行分離，降低這3個雜質在莫西克汀中的含量。

圖2 莫西克汀A雜質、F雜質、E雜質結構式[7]

1 材料、儀器和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

莫西克汀粗品由北大醫藥重慶大新藥業股份有限公司提供，顏色為淺黃色無定型粉末，為了現象更明顯，選擇收集了采用柱色譜層析分離過程中A、E、F較高的部分混合制作的粗品。

1.1.2 化學試劑

HPLC用的甲醇和乙腈均為色譜純，為國藥集團“沃凱”牌；液/液平衡使用的溶劑甲醇、甲苯、二氯甲烷、庚烷均為分析純，購置于國藥集團化學試劑有限公司；莫西克汀標準品為北大醫藥大新藥業股份有限公司提供。

1.1.3 主要實驗設備

島津高壓液相TL-2010；上海滬析RWD5頂置攪拌機實驗室電動攪拌機；500mL梨型玻璃分液漏斗；金壇DF101B集熱式磁力攪拌器恒溫水浴鍋電動攪拌器。

1.2 莫西克汀的標準曲線繪制

準確稱取莫西克汀標準品0.02516g(標準品ID號：177790，含量94.8%，產品編號：Y0000772)，置于25mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度線，配制成質量濃度為954μg/mL的莫西克汀標準母液，然后再依次稀釋成質量濃度分別為0.48、1.91、9.54、14.31、19.08、28.62μg/mL的莫西克汀標準溶液，將莫西克汀標準溶液在以下色譜條件下進樣檢測。色譜柱：Waters Nova Pak C18 4μm，Φ3.9mm×150mm；流動相：稱取乙酸銨約7.7g于400mL純化水中，然后使用冰醋酸將溶液調節至pH4.8，然后加入600mL的乙腈，混勻，過濾并脫氣，即得；流速：2.5mL/min；進樣量10μL；檢測波長：242nm；柱溫：50℃。以莫西克汀標準溶液的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3 不同組成的兩相溶劑對莫西克汀和雜質組分的分離效果

1.3.1 不同溶劑之間的相互溶解性

考慮到生產經常使用的溶劑，所以考慮到經濟性、毒性、安全性以及產品的溶劑殘留問題，選擇了甲苯、二氯甲烷、正庚烷為非極性相，分別和甲醇的不同濃度的水溶液組成的極性相溶劑，進行液液萃取。為了保證最大的分離效果，組成的兩相應該有最小的互溶度?？紤]到莫西克汀在甲醇溶液中的溶解度，所以考慮含有30%～50%甲醇的甲醇溶液。分別將甲苯等體積和50%甲醇溶液，40%甲醇溶液，30%甲醇溶液混合，同樣方法進行二氯甲烷、正庚烷的實驗，考察甲醇溶液和實驗的非極性相的互溶情況。

1.3.2 在常溫下非極性溶劑中莫西克汀的溶解度

根據上面實驗選定的非極性溶劑，考察此溶劑在常溫20～25℃下對莫西克汀的溶解性，取10mL選定溶劑于15mL的具塞磨口比色管內。緩慢向其中加入莫西克汀的固體粉末，密閉磨口塞情況下不斷震動溶解，直到有少許溶解不完后停止加入粗品，計量加入的粗品總量。再多次少量添加溶劑溶解，直到粗品剛剛溶解完全，計量添加的溶劑量，通過這種方式計算得到一個大概的溶劑對莫西克汀的溶解度。

1.3.3 正交對比不互溶的兩相溶劑中莫西克汀和雜質的分配效果

根據優選的非水溶性溶劑，進行30%、40%、50%甲醇溶液的平衡萃取實驗。每種濃度的甲醇溶液和非水溶性溶劑進行四次平衡萃取。檢測每次萃取后，甲醇溶液和非水溶性溶劑中的色譜純度和莫西克汀的單位變化。

2 結果與分析

2.1 莫西克汀的標準曲線的繪制

以莫西克汀標準液的質量濃度為縱坐標，峰面積為橫坐標繪制標準曲線，得到其回歸方程:y=0.0001X+0.1450，線性相關系數為0.9999。該標準曲線顯示莫西克汀在線性范圍0.48～28.98μg/mL范圍內具有良好的線性關系。根據此標準曲線能準確地得到莫西克汀的實際質量濃度(圖4)。

2.2 不同組成的兩相溶劑對莫西克汀和雜質組分的分離效果

2.2.1 不同溶劑之間的相互溶解性

實驗結果表明和甲醇溶液互溶性最小的是庚烷，其次是二氯甲烷，互溶性最好的是甲苯。所以選擇庚烷做為液液萃取相的非極性相。

2.2.2 在常溫下溶劑中莫西克汀的溶解度

實驗結果表明在20～25℃環境下，正庚烷對莫西克汀粗品的大致溶解度為8.3g/L。但是考慮到在大生產環境下能夠保證粗品的完全溶解，將庚烷溶解莫西克汀粗品的量調整到7.5～7g/L比較合理。

2.2.3 對比不互溶的兩相溶劑中莫西克汀和雜質的分配效果

如表1、2、3、4所示，通過四次萃取，使用等體積的30%、40%、50%甲醇溶液萃取粗品的庚烷溶解液后，A雜質的含量水平均降低到了1.5%以下，E+F雜質的含量水平均降低到了0.5%以下。雜質降低幅度最大的是50%甲醇水溶劑組，但是庚烷單次萃取收率和總萃取收率是最低的。綜合收率因素，30%甲醇溶液萃取組是效果最好的。最佳的萃取次數是三次。

圖4 莫西克汀標準曲線

表1 30%甲醇溶液和庚烷的液液萃取平衡含量變化

表2 40%甲醇溶液和庚烷的液液萃取平衡含量變化

表3 50%甲醇溶液和庚烷的液液萃取平衡含量變化

表4 三種濃度甲醇溶液和庚烷液液萃取的收率

3 討論

目前生產上用常壓柱層析純化的主要填料是苯乙烯-聚乙烯苯系大孔樹脂或無定型硅膠。由于處理量的要求，樹脂用量大、層析柱高，為了保證層析流速，層析填料只能采用大顆粒填料。例如代表性大孔樹脂日本三菱的HP20，其平均粒徑250μm；無定型硅膠一般為粒徑180～220μm，這兩者很難做到表1、2、3中液液萃取后庚烷相中A雜質、E+F雜含量水平。要到達同等水平，只能使用更細的填料，例如粒徑50μm大小中壓填料和粒徑20μm大小制備柱填料來再次精制，這需要付出高昂的成本—這體現在昂貴的填料價格和設備價格，較低的上柱量，使用大量的有機溶媒和回收帶來的高能耗、大量污水。

本實驗結果讓我們看到了另外一種使用較少成本代價達到降低雜質的目的方法。

本實驗只對抗生素生產中常用的幾種溶劑進行了初步篩選，確定了以30%甲醇溶液和庚烷進行液液萃取。該方法可能不是最優的結果，但是該方法過程操作簡單，對生產設備要求不高，絕大部分生產線不用改造即可使用。使用溶媒毒性低，來源廣泛，價格不高。綜合這些因素考慮，此方法是一個比較好的選擇。

實驗中發現在30%、40%、50%甲醇溶液和溶解粗品的庚烷溶劑進行萃取的過程中都存在幾個現象：

(1)隨著萃取次數的增加，萃取甲醇溶液層中莫西克汀和雜質的含量，與被萃取的庚烷層中莫西克汀和雜質的含量，趨于一致，暗示對雜質沒有了明顯的選擇性；(2)隨著萃取次數的增加，萃取甲醇溶液中莫西克汀的含量在逐步增加，說明甲醇溶液對產品的溶解度加大，但是到最后趨于一致；(3)A雜質，E和F雜質最初在甲醇溶液萃取液中的含量較高，隨著萃取次數的增加，含量急劇降低，最后趨于和莫西克汀的含量形成一個固定的比值。

這些現象暗示，在庚烷和甲醇溶液組成的兩相液/液萃取體系中，除去莫西克汀及雜質組分參與了分配平衡外，可能還有紫外檢測不到的物質參與了系統的分配平衡，是它改變了系統對莫西克汀和雜質的分配情況導致了萃取初期表現出了對A、E、F雜質的特異性選擇。隨著萃取次數的增多，其對系統分配平衡的影響在減弱，最終兩相系統的萃取平衡趨于一致。因此這種未知物質可能為我們提供一個思路，即嘗試找到起同樣效果的一種溶劑或者混合溶劑，通過在液/液萃取平衡中添加這種溶劑來實現每次都是特異性萃取的效果，這樣既降低了萃取中莫西克汀的損耗，也提高了雜質的去除效率。因此在后續工作中，我們會嘗試去尋找和驗證這種溶劑，繼續提高莫西克汀的收率。