橫向骨搬移技術對缺血肢體術區微循環重建的實驗研究

方志遠 王成偉 王雪 李飛

肢體缺血是一種常見且多發于下肢的臨床癥狀。在我國造成肢體缺血的主要病因是動脈粥樣硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎和糖尿病足等。下肢動脈硬化閉塞癥的發病率為 10%。隨著年齡的增長，其發病率呈上升趨勢，70 歲以上人群的發病率在 15%～20%。下肢缺血的主要臨床表現為下肢涼、麻木、無力、間歇性跛行、靜息痛和肢體缺血性潰瘍、壞疽等[1]。因其臨床表現嚴重，出現嚴重的間歇性跛行或靜息痛，肢體遠端缺血壞死或潰瘍，被迫截肢的危險性相對較高[2]。

近年來有臨床研究顯示，基于橫向骨搬移技術的牽拉組織再生的原理，骨瓣的橫向牽拉可以促進組織內微血管網絡的形成，從而改善患肢的的血液循環達到治療目的[3-4]。葉鋒等[5]，王召華等[6]及花奇凱等[7]國內眾多知名學者使用橫向骨搬移技術促進了下肢末梢潰瘍面的愈合。橫向骨搬移技術利用骨組織創傷后需要血管再生這一特點，達到重建血液循環，使下肢血流量增加，從而治療下肢血液循環障礙疾病。目前，此項基礎研究尚處于起步階段，國內外的相關文獻較少[8-9]。病例報道及動物實驗研究均表明脛骨橫向搬移術對治療下肢缺血性疾病確有明顯療效，但具體機制及其相關理論都有待于進一步研究證實[10]。該實驗旨在研究橫向骨搬移術區的微循環的變化，為進一步探討橫向骨搬移術的良好治療效果的分子生物學機制奠定基礎。

資料與方法

一、 資料

1. 實驗動物：選取 6 只 12 月齡比格犬，均為雌性，體質量 15.0～16.0 kg，平均 ( 15.7±0.6 ) kg，身長 ( 55±2 ) cm，脛骨長度平均為 ( 11.0±0.8 ) cm，體格健康、適中，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SYXK ( 新 ) 2018-0002。此次研究已取得新疆醫科大學動物實驗倫理委員會授權。

2. 設備：獸用紅外線體溫計 ( D-688 型康寧公司 ) 器械包 ( 新疆醫科大學第六附屬醫院 )。選用Siemens AXIOM Artis MP 多功能血管造影機，30 ml注射器，18G 靜脈留置針 ( 1.3 mm×30 mm，蘇州林華公司 )，對比劑選用碘帕醇注射液 ( 300 g / L，北京北陸公司 )。病理取材臺 ( 深圳市成科實驗室設備有限公司 )；包埋熱臺 ( 徠卡 LEICAEG 115067 )；包埋凍臺 ( 武漢漢谷醫療科技有限公司 HB-P3 )；脫水機 ( 徠卡 DT-2000B )；石蠟切片機 ( 徠卡 LEICARM 2135 )；烤片機 ( 恒宇 G2X-DH·300BS )；漂片機 ( 徠卡 HI1210 )；奧林巴斯相差顯微鏡 ( 日本OLYMPUS 6F41110 )；染色機 ( 新疆美奧爾康儀器有限公司 )。

3. 雙下肢缺血動物模型制備：應用國內、外肢體缺血模型建立的方法[11]。于 2018 年 9 月至 2019年 4 月依次選取比格犬對其進行雙后肢脛前動脈結扎術，將左后肢定為對照組，右后肢定為搬移組。由同一名高年資醫師完成脛前動脈結扎術及對比格犬進行脛骨橫向骨搬移術。( 1 ) 給予比格犬適應性喂養 3 天；( 2 ) 6 條比格犬均通過結扎雙側后肢脛前動脈建立缺血模型；( 3 ) 結扎脛前動脈后 1 天雙后肢行雙下肢血管造影 ( digital subtraction angiography，DSA )，再次確認雙下肢血管是否完全被結扎以明確下肢血管側支循環建立情況；( 4 ) 給比格犬戴嘴套，防止安裝搬移架之后犬撕咬搬移架情況的發生；( 5 ) 結扎脛前動脈后 1 天，安裝橫向骨搬移的特制牽引支架。無菌操作，于脛骨走向切開下肢皮膚，切口約 5 cm，在脛骨外側中段先鉆 2 小孔便于裝上搬移支架，再用微型擺鋸在脛骨外側以 2 小孔為中心開窗，切取 3 cm×1 cm 骨塊，避免損傷骨髓及周邊軟組織，將搬移支架固定于骨塊上，縫合軟組織及皮膚；( 6 ) 于對側搬移組的搬移術區同一水平面，對照組行脛前動脈走向切開同樣長度的下肢皮膚，切口約 5 cm，并縫合；( 7 ) 搬移組按脛骨橫向骨搬移術實施脛骨的橫向骨搬移[12]，并給予搬移組石膏固定，防止比格犬破壞搬移架。給予起旋特定搬移支架上的螺旋裝置，使骨塊每次向外搬移出0.35 mm / 次，2 次 / 天，間隔 4 h，搬移后 10 天，骨塊搬移出 7 mm。再將骨塊按此方式逆時針搬移后10 天骨塊搬移回原位；( 8 ) 每日堅持喂食及測定雙后肢的術區周圍的皮溫，觀察橫向骨搬移術后 21 天的 DSA 中的微動脈的數量及病理活檢中的微動脈的數量及脛前動脈結扎后 1 天的上述指標的變化；( 9 )搬移完畢后 2 天處死比格犬。

二、指標檢測

1. 一般情況：記錄所有比格犬脛前動脈結扎建模后 5 天內自主活動情況。

2. 術區的皮溫：檢測所有比格犬雙后肢術區周圍的圍術期搬移區的皮溫。

3. 雙后肢的 DSA：檢測所有比格犬雙脛前動脈結扎術后 1 天及實驗犬行橫向骨搬移術后 21 天的DSA。

4. 病理活檢：檢測所有犬行脛骨橫向骨搬移術后 21 天的雙下肢術區周圍的病理活檢。

三、統計學處理

采用 SPSS 20.0 統計軟件對數據進行分析，應用完全隨機樣本的方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1. 圍術期的一般情況：6 條比格犬術后步態均正常 ( 圖 1 )，未出現跛行。

2. 圍術期術區的皮溫比較：圍術期期間，6 條實驗犬搬移組的術區皮溫可見明顯變化，而對照組的術區皮溫未見明顯變化 ( 表1 )。

3. 雙后肢術區的 DSA：將 6 條比格犬行雙后肢 DSA。通過觀察 DSA 影像，可發現 ( 1 ) 在搬移組中，橫向骨搬移術后 21 天的術區微循環 ( 圖 2a ) 明顯較脛前動脈結扎術后 1 天的術區的微循環 ( 圖 2b )豐富；( 2 ) 在對照組中，實驗犬實行橫向骨搬移術后21 天的術區的微循環 ( 圖 2c ) 較脛前動脈結扎術后1 天的術區微循環 ( 圖 2d ) 未見明顯變化；( 3 ) 在實驗犬行橫向骨搬移術后 21 天，搬移組術區的微循環( 圖 2a ) 明顯較對照組術區的微循環 ( 圖 2c ) 豐富。

4. 雙后肢術區的病理活檢：實驗犬行橫向骨搬移術后 21 天，行雙后肢術區病理活檢。通過病理活檢的對比可發現，搬移組術區微循環數量 ( 圖 3a )明顯較對照組多 ( 圖 3b )。

表1 對照組與搬移組的圍術期術區皮溫 (，±s，n = 6 )Tab.1 Perioperative skin temperatures of the control group and transfer group (, ±s, n = 6 )

組別 結扎前 結扎后 搬移后 21 天 F 值 P 值對照組 32.5±0.5 32.1±0.3 32.3±0.2 1.895 0.185images/BZ_52_1530_1356_1533_1356.png搬移組 33.1±0.3 33.2±0.3 33.3±0.1 32.526 0.0002 t 值 2.521 0.577 10.954 - -P 值 0.030 0.576 0.0015 - -

圖1 實驗犬的術后步態觀察 a～b：實驗犬術后步態均正常Fig.1 Postoperative gait of experimental dogs a - b: Normal gait after operation

圖2 雙后肢術區的 DSA a：搬移組：橫向骨搬移術后 21 天的術區微循環；b：搬移組中脛前動脈結扎術后 1 天的術區微循環；c：對照組：實驗犬實行橫向骨搬移術后 21 天的術區微循環；d：對照組中脛前動脈結扎術后 1 天的術區微循環Fig.2 Double hind limb DSA a: Microcirculation of the transfer group 21 days after transverse bone transfer; b: Microcirculation of the transfer group 1 day after tibial artery ligation; c: Microcirculation of the control group 21 days after transverse bone transfer; d: Microcirculation of the control group 1 day after tibial artery ligation

圖3 實驗犬行橫向骨搬移術后 21 天雙后肢術區的病理活檢a：對照組的術區病理活檢；b：實驗組的術區病理活檢Fig.3 Double hind limb pathological biopsy 21 days after transverse bone transfer a: Pathological biopsy of the control group; b:Pathological biopsy of the transfer group

討 論

下肢缺血性疾病主要包括血栓閉塞性脈管炎和動脈硬化性閉塞癥[5]。目前，臨床上治療血栓閉塞性脈管炎的方式包括保守藥物治療和微創血管介入，其療效有待進一步提高，因此患者必須接受手術治療[13]。選用股、-遠端脛動脈旁路轉流術，腰交感神經切除術或大網膜移植術、動靜脈轉流術、腔內血管成形術或橫向骨搬移技術。其中，橫向骨搬移技術在治療肢體缺血疾病中的療效最優[14]。

橫向骨搬移技術的原理是通過拉力效應反復刺激脛骨骨髓，血管內皮細胞的有絲分裂和組織再生，從而重建血液循環并避免截肢[15]。目前，臨床上治療下肢微循環閉塞疾病的方式包括保守藥物治療和微創血管介入，其療效有待進一步提高，因此患者必須接受手術治療[13]。盡管橫向骨搬移技術對骨塊的搬運以及血管再生和循環重建在臨床上仍處于促進階段，但已廣泛認識到該術式可刺激軟組織的再生[16]。橫向骨搬移技術作為微循環重建技術的臨床應用之一[17]，既是對顯微外科的一種拓展，也是對微血管再生技術的突破；橫向骨搬移技術在治療下肢缺血性疾病時組織微循環得到有效的改善[18]。但在國內外針對橫向骨搬移技術的動物實驗報道甚少[8-9]，國內外學者對橫向骨搬移技術能促進微循環再生的機制尚未有統一的解釋。本研究通過動物實驗，對橫向骨搬移技術的手術區域的微循環變化進行了進一步的基礎研究，旨在為進一步深入研究橫向骨搬移技術的良好治療效果的分子生物學機制奠定基礎。

一、雙后肢術區的皮溫

通過觀察 6 條實驗犬行橫向骨搬移術后 21 天的雙后肢的術區皮溫較脛前動脈結扎后 1 天的雙后肢術區皮溫的變化情況發現，在搬移組中，實驗犬行橫向骨搬移術后 21 天的術區皮溫較脛前動脈結扎術后 1 天的術區皮溫明顯增高；而在對照組中，實驗犬行橫向骨搬移術后 21 天的術區皮溫未較脛前動脈結扎術后 1 天的術區皮溫增高，故側面反映了實驗犬行橫向骨搬移術后 21 天搬移組的術區微循環明顯較脛前動脈結扎術后 1 天的術區微循環增多。此結果與徐浩博教授通過橫向骨搬移技術治療 7 例血栓閉塞性脈管炎患者的治療中，所發現的橫向骨搬移術的術區的皮溫增高的結論相吻合[5]。Zuo 等[18]也在對 90 例下肢慢性缺血性疾病患者的治療中發現，橫向骨搬移技術可有效升高下肢溫度，有助于下肢的血運重建，并改善患者的臨床癥狀。

二、雙后肢術區的 DSA

通過對比搬移組橫向骨搬移術后 21 天的 DSA與脛前動脈結扎術后 1 天的 DSA，可見搬移組術區于橫向骨搬移術后 21 天的微循環明顯較脛前動脈結扎術后 1 天的微循環豐富。再通過實驗犬脛骨橫向骨搬移術后 21 天的搬移組術區的 DSA 與對照組術區的 DSA 對比，可見搬移組術區的微循環明顯較對照組術區的微循豐富，且通過對比實驗犬脛骨橫向骨搬移術后 21 天的對照組術區的 DSA 與脛前動脈結扎術后 1 天的對照組術區的 DSA，發現實驗犬于橫向骨搬移術后 21 天的微循環數量與脛前動脈結扎術后 1 天的對照組術區的微循環數量未見明顯變化。提示橫向骨搬移技術能明顯促進缺血實驗犬的橫向骨搬移術區的微循環再生。該研究結果與曲龍教授應用橫向骨搬移技術治療 1 例血栓閉塞性脈管炎患者時，通過對該患者雙下肢 DSA 所發現的橫向骨搬移術區周圍形成了豐富的血管網絡的結論相符合[11]。

三、雙后肢術區的病理活檢

于實驗犬行橫向骨搬移術后 21 天，對其雙后肢術區進行病理活檢，通過對比實驗組橫向骨搬移術的術區病理活檢與對照組切口區域內的病理活檢，發現實驗組術區微動脈明顯較對照組切口區域內的微動脈增生。進一步直觀論證了橫向骨搬移技術可以促進術區周圍的微循環再生。

在臨床治療中，橫向骨搬移技術治療肢體缺血性疾病獲得較好的效果，微循環得到明顯改善[18]，療效確切且進一步驗證了脛骨橫向骨搬移術可促進術區的微循環，為深入研究橫向骨搬移技術對缺血肢體末梢微循環重建的良好治療效果的分子生物學機制奠定基礎。