灰霉病對番茄葉片蔗糖轉化酶活性和可溶性糖含量的影響

彭家麗　趙虎　李智佳　彭夢醒　劉永華

摘要 研究灰霉病菌接種后番茄葉片中蔗糖轉化酶介導的糖分代謝的變化規律及其與發病程度之間的相關性，初步闡明蔗糖轉化酶在調控番茄-灰霉病菌互作中的重要作用。通過系統測定灰霉病菌接種后不同時期（0、12、24和48 h）番茄葉片中蔗糖轉化酶活性、淀粉和可溶性糖含量、細胞死亡程度和H2O2積累的動態變化，結果發現，灰霉病菌接種導致番茄葉片細胞壁轉化酶（CWIN）、細胞質轉化酶（CIN）和液泡轉化酶（VIN）活性顯著上升，其中CWIN活性最先上升且上升幅度最大，其次為CIN，最后為VIN;同時，CWIN和CIN活性在接種早期（12和24 h）上升幅度較小，而在接種后期（48 h）上升幅度較大;霉病菌接種導致番茄葉片中淀粉含量和己糖/蔗糖顯著降低，但對蔗糖、葡萄和果糖含量沒有顯著影響;灰霉病菌接種導致番茄葉片在接種早期（24 h）發生顯著的細胞死亡和H2O2積累現象?？傊?，灰霉病菌接種導致3種轉化酶活性顯著上升，但由于其活性在接種早期上升幅度較小，其分解蔗糖產生的己糖（葡萄糖和果糖）不能滿足植物防御反應的需要而出現己糖/蔗糖下降，這導致植物不能通過糖信號途徑及時啟動防御反應來有效清除H2O2并防止細胞死亡的發生，最終導致灰霉病的發生。

關鍵詞 灰霉病;細胞壁轉化酶;細胞質轉化酶;液泡轉化酶;己糖/蔗糖

中圖分類號 S641.2文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）11-0156-05

Abstract To elucidate important roles of invertase in regulating tomatoB. cinerea interaction， the changes of invertasemediated sugar metabolism in tomato leaves after Botrytis cinerea inoculation and their correlation with the progress of grey mould incidence were studied. The dynamics of invertase activities， starch and soluble sugar content， cell death degree and H2O2 accumulation in tomato leaves at different timepoints （0， 12， 24 and 48 h） after B. cinerea inoculation were systematically investigated. It was found that cell wall invertase （CWIN）， cytoplasmic invertase （CIN） and vacuolar invertase （VIN） of tomato leaves were significantly increased after B. cinerea inoculation;among three kinds of INVs， CWIN activity was induced earliest and most dramatically， followed by CIN and VIN. Furthermore， induction of CWIN and CIN activity was moderate at the early stage of inoculation （12 and 24 h）， but was dramatic at the late stage of inoculation （48 h）. Starch content and hexose/sucrose in tomato leaves was significantly decreased after B. cinerea inoculation， but the content of sucrose， glucose and fructose was not significantly affected. In addition， B. cinerea inoculation resulted in significant cell death and H2O2 accumulation in tomato leaves at the early stage of inoculation （24 h）. Collectively， B. cinerea inoculation significantly induced the activities of three kinds of INVs. However， because the induction of INV activities was moderate at the early stage of inoculation， hexose derived from INVmediated sucrose degradation could not meet the need of plant defense response for hexose， which led to reduced hexose/sucrose. Thus， tomato plants fail to activate its defense response to effectively scavenge H2O2 and therefore prevent the incidence of H2O2induced cell death.

Key words Botrytis cinerea;Cell wall invertase;Cytoplasmic invertase;Vacuolar invertase;Hexose/sucrose

番茄（Solanum lycopersicm）是我國乃至世界上重要的蔬菜作物之一。據聯合國糧農組織統計，2017年世界番茄總產量高達1.82億t。番茄灰霉?。˙otrytis cinerea）在世界各番茄產區均有發生，是一種發生普遍且危害較重的真菌病害[1-3]。發病時，一般造成番茄產量損失20%～40%，嚴重時高達60%以上[4-6]。然而長期大量使用化學試劑不可避免地導致灰霉病原菌逐漸產生抗藥性，導致一些常規藥劑失去作用，而且還會嚴重影響人體健康和生態環境[7-9]。通過研究番茄與灰霉病菌互作的生理生化機制，有助于選育抗灰霉病品種，從而克服上述化學防治的缺點。

蔗糖是高等植物葉片光合產物向庫器官運輸的主要形態，蔗糖分解代謝在植物對病原菌的防衛反應中發揮著重要作用。一方面，可以為植物防衛反應提供碳骨架和能量。如細胞壁加厚，植物抗毒素的合成以及抗病相關蛋白的積累等防衛反應都需要大量的糖分供應[10]。另一方面，蔗糖分解產生的葡萄糖和果糖也可為病菌的生長發育提供能量和碳骨架[11]。植物體內參與蔗糖分解的有蔗糖合成酶（sucrose synthase，Sus）和蔗糖轉化酶（invertase，INV）;Sus調控的蔗糖分解為可逆反應，既可以催化蔗糖合成又可以催化蔗糖分解，但通常認為Sus在植物體內主要起分解蔗糖作用[12-13]。INV則不可逆地將蔗糖（sucrose，Suc）水解為葡萄糖（glucose，Glc）和果糖（fructose，Fru）。INV根據其亞細胞定位不同，可以進一步細分為細胞壁轉化酶（cell wall invertase，CWIN）、液泡轉化酶（vacuolar invertase，VIN）和細胞質轉化酶（cytoplasmic invertase，CIN）[14]。

目前對蔗糖分解代謝在植物抗病性方面的研究主要集中在CWIN。研究表明，CWIN在植物抗病性中發揮著積極作用。如超表達CWIN基因的水稻對細菌性病菌Xanthomonas oryzae pv.Oryzae和真菌性病菌Magnaporthe oryzae抗性均明顯增強[15]。與此相應，抑制CWIN表達則會降低植物的抗病性。如通過RNA干擾技術抑制煙草中CWIN的表達導致植株對卵菌病原菌Phytophthora nicotianae的抗性降低[16]。但也有研究表明，CWIN在植物抗病性中發揮著負面作用。如番茄CWIN基因LIN8的沉默不僅沒有降低番茄葉片的抗病性，反而增加對細菌性病菌Xanthomonas campestris pv.vesicatoria（Xcv）的抗性[17]。同樣，通過超表達CWIN抑制因子的方法降低CWIN的活性導致擬南芥對真菌病菌Plasmodiophora brassicae的抗性增加[18]。因此，CWIN在植物抗病中的作用可能受植物和病菌種類的影響。

此外，其他蔗糖分解酶也在植物抗病中發揮重要作用。如酵母轉化酶基因在煙草液泡中的超表達可以增強煙草對馬鈴薯Y病毒的抗性[19]。擬南芥的CIN突變體（Atcinv1）對根結線蟲和孢囊線蟲的抗性下降[20]。然而對小麥的研究表明，CIN基因Ta-A/N-Inv1的下調反而增強植株對條銹病病菌Puccinia striiformis的抗性[21]。因此，和CWIN類似，CIN在植物抗病中的作用可能同樣受植物和病菌種類的影響?？傊?，蔗糖轉化酶在植物抗病中發揮著重要作用，但其具體作用可能是正面的，也可能是負面的，可能受到不同植物或病原菌種類的影響。目前有關Sus在植物抗病中的作用研究則較少。

目前有關灰霉病對番茄葉片蔗糖分解代謝影響的研究較少。因此，筆者研究接種灰霉病后不同時期番茄葉片中蔗糖轉化酶活性（CWIN、CIN和VIN）、可溶性糖含量（Suc、Glc和Fru）的動態變化，同時對淀粉和過氧化氫（H2O2）進行原位染色，以期鑒定出對灰霉病菌侵染響應最為敏感的轉化酶種類，初步闡明蔗糖代謝在番茄抵抗灰霉病菌侵染的生理生化機制，為下一步通過轉基因及分子育種等現代生物技術手段提高番茄對灰霉病的抗性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用番茄品種為新疆農業科學院園藝研究所育成的“新番2號”。番茄栽培在海南大學實驗基地塑料大棚內進行，將番茄種子消毒后播種到預先裝滿蛭石32孔的穴盤內。播種約30 d后，番茄幼苗達到4葉1心，此時將幼苗定植到花盆內（上、下部直徑為25.4和17.8 cm，高19.7 cm），基質為田園土∶羊糞（1∶1），再加一定量復合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）。每盆定植1株苗，共種植20株。番茄定植28 d后，取大小、形狀和植株部位相同的番茄葉片進行灰霉病菌離體接種試驗。

1.2 方法

1.2.1 灰霉病菌的培養和接種。

番茄灰霉病菌（B.cinerea）由海南大學植物保護學院劉銅教授惠贈。將灰霉病菌接種到V8培養基上培養，在黑暗、23 ℃恒溫條件下培養約14 d后產生大量分生孢子。孢子懸浮液配制和離體接種均參照Lian等[22]的方法并作適當調整：用SMB液體培養基（1%蛋白胨，4%麥芽糖，pH 5.6）配制孢子懸浮液，調整孢子最終濃度至5×105/mL。在直徑9 cm的培養皿中倒入25 mL濃度0.8%的瓊脂，待瓊脂凝固后將清洗干凈的番茄葉片的葉柄嵌入瓊脂中并保持葉片平整。在每片葉片的主脈兩側各接種3滴孢子懸浮液，每滴5 μL，密封后在黑暗條件下培養（23 ℃恒溫）。對照則接種不含孢子的SMB液體培養基。在接種0、12、24和48 h后分別進行取樣，用直徑1 cm的打孔器以菌液滴為中心打孔取樣并稱重，液氮速凍后在-80 ℃下存放，用于酶活性和糖含量測定。每個處理含5個生物學重復。

1.2.2 蔗糖轉化酶活性和可溶性糖含量的測定。

INV活性的測定參照Tomlinson等[23]的方法;蔗糖、葡萄糖、果糖含量的測定參照King等[24]的酶學方法。

1.2.3 細胞死亡染色。

番茄葉片在接種12、24和48 h后細胞死亡染色，具體方法參照Bai等[25]的方法。將番茄葉片在1∶1的乙醇和染色液（將10 mL乳酸、10 mL甘油、10 g苯酚和10 mg臺盼藍溶于10 mL蒸餾水中）配制的混合液中煮沸5 min進行染色，然后在2.5 g/mL的水合氯醛溶液中進行脫色處理，最后對葉片進行拍照。

1.2.4 淀粉和H2O2原位染色。

葉片淀粉染色參考Sosso等[26]的方法。將番茄葉片在95%乙醇中煮沸30 min將葉綠素完全去除，然后將葉片在I-KI溶液（將1 g 碘和1 g碘化鉀溶于100 mL水中）中染色15 min，然后用清水沖洗2次，最后進行拍照記錄。

葉片H2O2染色參考ThordalChristensen等[27]的方法，將番茄葉片放入1 mg/mL的DAB（3，3-diaminobenzidine）溶液中，在-80 kPa下抽真空7 min（共重復3次，中間輕輕振蕩去除葉片表面的氣泡），然后避光室溫下放置30 min。最后在95%乙醇中煮沸10 min去除葉綠素后進行拍照，存在H2O2的部位在染色后呈棕紅色。

1.3 數據處理

利用 Excel 2010軟件對試驗數據進行作圖和t-test 分析。

2 結果與分析

2.1 灰霉病菌接種不同時期病斑和細胞死亡情況

對接種后12、24、48 h的番茄葉片進行觀察，發現在接種后12和24 h未出現肉眼可見的病斑，只是在48 h觀察到明顯病斑（圖1）。在此基礎上，進一步對上述4個時期的葉片進行臺盼藍染色，以觀察葉片細胞死亡情況，發現在12 h，接種部位并未出現細胞死亡現象，但在24 h已經開始出現細胞死亡現象（圖1中箭頭所示），到48 h時細胞死亡出現的面積更大（圖1）。這表明，雖然在接種后24 h葉片并未出現明顯的病斑，但在接種部位已經開始發生細胞死亡現象，表明此時病菌已經成功侵染進入葉片細胞。在接下來的試驗中，重點研究灰霉病菌侵染前2個時期（0和12 h）和侵染后2個時期（24和48 h）番茄葉片中蔗糖轉化酶活性（CWIN、CIN和VIN）和可溶性糖（蔗糖、葡萄糖和果糖）含量的動態變化。

2.2 灰霉病菌侵染對番茄葉片轉化酶活性的影響

對不同接種時期轉化酶活性的測定表明，無論接種與否，葉片中的3種轉化酶CWIN、CIN和VIN活性均呈快速上升趨勢（圖2）。但與對照相比，病菌接種情況下3種轉化酶活性的上升幅度更大，表明病菌侵染誘導了3種轉化酶的活性。進一步分析表明，CWIN活性在接種后12 h已經顯著高于對照，在12、24和48 h分別較對照增加48%、31%和268%（圖2A），而CIN在接種后24 h顯著高于對照（圖2B），在24和48 h分別較對照增加61%和101%;和CIN類似，VIN也是在接種后24 h顯著高于對照，但僅比對照高31%，且其活性在接種后48 h和對照無顯著差異（圖2C）。上述證據表明，灰霉接種對3種轉化酶活性均產生誘導效應，其中CWIN活性最先受到誘導，CIN和VIN活性隨后受到誘導，且VIN活性受到誘導的時間較短;在3種轉化酶中，CWIN和CIN活性受病菌誘導上升的幅度大于VIN。

2.3 灰霉病菌侵染對番茄葉片可溶性糖含量的影響

通常情況下，病菌侵染會誘導可溶性糖分在侵染部位的積累，從而為植物防御反應提供養分和能量[14]。因此，進一步測定番茄葉片接種部位中的可溶性糖含量（蔗糖、葡萄糖和果糖）。結果表明，3種可溶性糖含量在整個調查時期內（接種后0～48 h）均呈先上升后下降的變化趨勢，但3種可溶性糖含量在接種葉片和對照葉片之間無顯著差異，表明灰霉病菌接種對葉片中的可溶性糖含量無顯著影響（圖3A～C）。雖然與對照相比，接種后葉片中的可溶性糖含量沒有變化，但己糖/蔗糖在接種后呈降低趨勢，在接種后48 h顯著低于對照（圖3D）。由于高的己糖/蔗糖可誘導植物的抗病反應[14]，因此己糖/蔗糖的降低可能會導致植物的抗病能力下降。

2.4 灰霉病菌侵染對番茄葉片淀粉和H2O2積累的影響

對葉片中的淀粉進行原位染色，結果發現在接種后0 h時，藍黑色的淀粉信號均勻分布在整個葉片（圖4A）;在接種病菌24 h后葉片雖然沒有病斑出現，但在接種部位已經出現藍黑色信號消失的現象，表明接種部位的淀粉已經消耗殆盡;接種病菌48 h后，整個葉片的淀粉幾乎被完全消耗，特別是在接種部位及其附近幾乎沒有淀粉信號的存在，只是離接種部位較遠的部位還有少量淀粉存在。對照葉片在培養48 h后藍黑色的淀粉信號只是出現微弱的下降，而且淀粉信號均勻分布于整個葉片（數據未列出）。上述結果表明，灰霉病菌接種會導致接種部位及其附近的淀粉含量大幅下降。

此外，對葉片H2O2的原位染色表明，在接種后0 h時，在葉片中未檢測到任何棕紅色的H2O2信號（圖4B）。在接種病菌24 h后葉片雖然沒有病斑出現，但在接種部位已經檢測到H2O2信號;在接種病菌48 h后，伴隨著病斑的出現H2O2信號顯著增強，但主要局限于接種部位，只是在緊鄰接種部位的地方出現微弱的H2O2信號。對照葉片在培養48 h后并未出現明顯的H2O2信號（數據未列出）。上述結果表明，灰霉病菌接種會導致接種部位H2O2含量大幅上升。

3 結論與討論

蔗糖分解代謝不僅可以為植物的防御反應提供能量和碳骨架用于各種抗菌物質的合成，也可以作為信號分子調控植物抗病基因的表達[14];此外，病菌生長發育所需的糖分也來自于植物蔗糖的分解，因為絕大部分植物病原菌包括灰霉病菌主要是利用葡萄糖和果糖作為其能量來源[28-29]。因此，植物體內的蔗糖分解酶在植物抗病中發揮著重要作用。目前研究主要集中在轉化酶特別是CWIN在植物抗病中的作用[30]。

目前仍不清楚蔗糖轉化酶在番茄抵御灰霉病侵染中的具體作用。筆者系統研究了灰霉病菌侵染對番茄葉片中3種轉化酶（CWIN、CIN和CIN）活性的影響，結果發現灰霉病菌侵染會顯著誘導番茄葉片中3種轉化酶活性的上升。這和其他研究中的發現類似。如辣椒接種Xanthomonas campestris pv.vesicatoria（Xcv）后，其葉片中的CWIN和VIN活性持續增加，同樣煙草葉片接種Xcv后，CWIN活性也顯著增加[31]。通過進一步分析表明，首先，3種轉化酶活性受到病菌侵染誘導的時期不同。其中CWIN轉化酶活性受到誘導的時間最早（接種后12 h），而CIN和VIN活性受到誘導的時間較晚（接種后24 h）。值得注意的是，CWIN活性的上升發生在葉片細胞死亡出現之前（接種后12 h），而CIN和VIN活性的上升則出現在葉片細胞死亡之后（接種后24 h）。此外，雖然CIN和VIN的活性都是在接種后24 h受到誘導，但CIN的誘導可持續到接種后48 h，而VIN活性在接種后48 h時和對照已無顯著差異。其次，3種轉化酶在病菌侵染后上升的幅度不同。其中CWIN活性最高比對照增加268%，CIN最高比對照增加101%，而VIN最高僅比對照增加31%。因此，從活性誘導時期和活性上升幅度來看，CWIN對灰霉病菌侵染響應最為靈敏，其次為CIN，最后為VIN。這表明和CIN與VIN相比，CWIN可能在番茄-灰霉病菌互作中發揮著更為重要的作用。

轉基因證據表明蔗糖轉化酶特別是CWIN在植物抗病中發揮著重要作用，但受不同植物或病菌種類的影響，其具體作用可能是正面的，也可能是負面的。該研究結果表明，雖然接種后轉化酶活性的大幅上升，但植物仍出現嚴重的病癥，表明病菌侵染所誘導的轉化酶活性上升似乎更有利于灰霉病菌的發育，而不利于植物的抗病性。有觀點認為，CWIN活性的小幅上升可為病菌生長發育提供更多的己糖，從而降低植物的抗病性，而CWIN活性的大幅上升才能產生足夠的己糖信號來激活植物的抗病反應[14，32]。如接種病菌Pst DC3000后，抗病擬南芥植株葉片中的CWIN活性上升幅度遠高于不抗病擬南芥植株[33]。細菌性病害Xanthomonas campestris pv.vesicatoria（Xcv）甚至可以向辣椒細胞中分泌一種致病蛋白因子來抑制辣椒CWIN活性的上升，從而降低辣椒的抗病能力[31]。在該研究中，CWIN活性在接種后12 和24 h分別上升48%和31%，只有在接種后48 h才大幅上升268%。同樣CIN活性在接種后24 h上升61%，而在48 h大幅上升101%。這表明CWIN和CIN在病菌侵染早期活性上升幅度較小，這可能會促進灰霉病菌的生長發育，導致植物發病。對葉片中己糖/蔗糖的測定也驗證了此推論，病菌侵染后番茄葉片中的己糖/蔗糖比值呈下降趨勢，表明CWIN和CIN活性的小幅上升并不能提高己糖/蔗糖，因此不能激活植物的抗病反應。

伴隨著轉化酶活性的上升，灰霉病菌侵染并沒有改變葉片中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量。類似的現象也存在于其他植物病菌互作系統中。如水稻和擬南芥分別受到水稻白葉枯菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）和Pst DC3000的侵染后，其葉片中的可溶性糖含量都未發生顯著變化[34-35]。雖然糖分含量未發生變化，但糖分消耗速率可能已經發生了較大變化。因為在接種24和48 h后，接種部位及其附近的淀粉含量大幅下降，表明灰霉病菌侵染導致葉片對糖分的消耗速率顯著增加。一般認為，植物葉片中儲存的淀粉在被植物利用之前需要首先轉化為蔗糖運輸到需要糖分的部位，然后蔗糖被進一步分解為葡萄糖和果糖用于植物的生長發育[14]。但該研究揭示伴隨著病菌侵染和淀粉含量的下降，番茄葉片中的蔗糖或己糖（葡萄糖和果糖）含量并未顯著上升?？赡艿暮侠斫忉尵褪墙臃N后轉化酶活性的大幅上升可迅速將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，而葡萄糖和果糖又被植物或病菌快速的消耗利用。因此，雖然病菌侵染導致淀粉含量下降，但并沒有出現可溶性糖含量顯著升高的現象。

作為防御反應之一，植物受到病原菌侵染時會增強其清除活性氧的能力，從而避免活性氧過量積累所導致的植物細胞死亡[36]?；颐共≡且环N腐生型病原菌，葉片細胞的死亡可為其提供包括糖分在內的其他許多養分，從而增加其致病性[37]。該研究對番茄葉片細胞死亡和H2O2的原位染色表明，接種灰霉病菌24 h后，雖然還不能肉眼觀察到番茄葉片上病斑的出現，但此時已經發生明顯的細胞死亡和H2O2積累現象。這表明番茄葉片不能及時有效清除活性氧和避免細胞死亡的出現，最終導致灰霉病的發生。

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