白樺脂酸通過抑制NLRP3/NF-κB 信號通路保護四氯化碳所致肝損傷的機制研究*

嚴麗軍，徐立新，何紅梅，居玲玲，張湘云，邵建國***

(南通大學附屬南通第三醫院1 肝病科，2 消化內科，3 腫瘤科，南通 226006)

肝纖維化是指肝臟內彌漫性細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的過度沉積，它不是一個獨立的疾病，是許多慢性肝病共同的病理過程，幾乎各種慢性肝病(化學毒性、感染性、遺傳代謝性、自身免疫性以及膽汁淤積性)均可導致肝纖維化[1-2]。早已證實肝纖維化及早期肝硬化都是能夠實現逆轉的。ECM生成及降解過程中所出現的失衡是肝組織在發生纖維化過程中重要的可逆性病理變化[3]。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)已被證實是彌漫性ECM的重要來源之一，且激活HSC 轉變為肌成纖維細胞(myo fibroblast,MFB)是肝纖維化發生的中心環節[4-5]。HSC 活化過程中會產生大量的促炎細胞因子、趨化因子和分子，炎癥是HSC 活化過程的關鍵因素[6]。許多炎癥因子在HSC 的活化過程中起關鍵作用，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-1β 和IL-6 等。此外，核因子(nuclear factor,NF)-κB、活性氧、脂質過氧化產物和多種生長因子均可促進HSC 的活化，與MFB 積累在一起，最終導致肝纖維化多種信號通路的核心病理生理改變[7]。

四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)是最有效的肝毒性化合物之一，使用CCl4構建的動物肝損傷模型是肝損傷的經典模型[8]。CCl4經依賴于細胞色素P450 的氧化酶激活后，分解為CCl3-和Cl-，而這些自由基會導致活性氧及脂質過氧化物的過量產生，進而對肝細胞產生損傷，促進肝纖維化的發生發展[9]。因此，本實驗采用CCl4復制肝損傷小鼠模型。

核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(nucleotidebinding oligomerization domain,jeucine rich repeat and pyrin domain containing,NLRP3)炎性小體是一種存在于細胞質中的蛋白復合物，是宿主免疫防御系統的重要成員，主要參與體內炎性反應，其主要組成包括NLRP3、效應蛋白胱天蛋白酶-1(Caspase-1)及凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)[10]。NLRP3 炎性小體在肝臟中主要位于肝細胞，Caspase-1 對于將IL-1β未成熟型轉化為活性型至關重要，NLRP3 對刺激的反應需要NF-κB 信號通路的參與。

白樺脂酸(betulinic acid,BA)是一種羽扇豆烷型五環三萜皂苷，存在于多種天然植物的樹皮中，主要在樺木屬中。研究[11-14]已證實BA 具有抗腫瘤、抗炎、抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、抗人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、免疫調節等多種藥理作用。但關于BA 是否對肝損傷有益的研究仍很少。因此，本研究旨在評估BA 對肝損傷發生時肝纖維化的影響，并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 藥物 BA 和水飛薊素(silymarin,SL)(純度均為97%)均購自天津萬象恒遠科技有限公司，且均使用5%CMC-Na 進行混懸備用，BA 高、低劑量濃度分別為4、2 mg/mL；CCl4(純度為99.5%)購自上海阿拉丁生化科技公司。

1.2 動物來源 購自南通大學實驗動物中心的60只C57BL/6 小鼠(雄性，8～12 周齡，20～22 g)，飼養條件為室溫(22±1)℃、空氣濕度40%～50%、晝夜交替時間12 h、普通喂養及自由飲水，動物實驗由南通大學實驗動物倫理委員會批準。

1.3 試劑 IL-6、IL-1β 和TNF-α 酶聯免疫試劑盒采購于Elabscience 公司(批號為Ex210804)；NLRP3、甘油醛-3-磷酸脫氧酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、ASC、Caspase-1、(p-)NFκB、IL-1β、(p-)IκBα 抗體均來源于Cell Signaling Technology。

1.4 儀器 曝光儀(型號：Tanon 5200，上海天能科技)；臺式離心機(美國SCILOGEX 公司)；DYC 電泳儀(北京六一儀器廠)；酶聯免疫檢測儀(型號：680 型，上海眾生聲明科學)。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組與給藥 60 只C57BL/6 小鼠隨機分為5組：空白對照組、CCl4組、CCl4+SL(100 mg/kg，陽性藥物)、CCl4+BA 低劑量組(20 mg/kg)、CCl4+BA 高劑量組(40 mg/kg)，皮下注射CCl4(橄欖油1∶1)誘導小鼠肝纖維化，劑量為3 mL/kg，每周2 次，連續6 周?？瞻讓φ战M小鼠注射等量無CCl4的橄欖油。建立肝纖維化模型后，BA組小鼠灌胃BA 20、40 mg/kg，SL組小鼠予SL 100 mg/kg 溶于生理鹽水灌胃，連續6 周?？瞻讓φ战M和CCl4組小鼠接受等量生理鹽水。

1.5.2 血清谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase,AST)含量測定 末次給藥24 h 后小鼠眼眶采血，于4 500 r/min 離心15 min 后取上清液凍存于-80 ℃備用，依據試劑盒說明書對CCl4所引發的肝臟損傷小鼠模型血清中ALT、AST 的水平進行檢測。

1.5.3 血清及肝臟組織中細胞因子測定 末次給藥24 h 后眼眶取血，離心15 min(4 500 r/min)后將其上層清液取出并儲于-80 ℃備用，依據酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書對5組小鼠血清中細胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平進行檢測。用RIPA 裂解液提取各組小鼠肝臟組織總蛋白，離心15 min(12 000 r/min)后將其上層清液取出并儲于-80 ℃條件中備用，依據試劑盒說明書檢測5組小鼠肝臟組織中細胞因子(IL-6、IL-1β 和TNF-α)的含量。

1.5.4 肝臟組織病理學觀察 將處死后的小鼠肝組織取出，4%甲醛固定，石蠟包埋制成厚4 mm 的薄片，進行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色，置于顯微鏡下對肝組織的病變情況進行觀察。

1.5.5 免疫組化法測定小鼠肝臟中NLRP3 和p-NF-κB-p65 的表達情況 用4%多聚甲醛固定肝組織，將其包埋在石蠟中并切片，將石蠟切片在二甲苯和無水乙醇中脫蠟，在檸檬酸鈉緩沖液中微波干燥，并用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌；內源性過氧化物酶活性被3%H2O2阻斷20 min；將每個樣品用5%山羊血清封閉20 min，然后在4 ℃下用一抗NLRP3(1∶200)和p-NF-κBp65(1∶200)處理；第2 天，PBS 洗滌3 次后，用山羊抗兔IgG 二抗處理20 min，然后將辣根過氧化物酶標記的抗生蛋白鏈菌素工作液孵育20 min，PBS 洗滌3 次，然后用3-3′二氨基聯苯胺染色，最后蘇木精染色，脫水并干燥后，將切片用中性膠固定并在顯微鏡下觀察。

1.5.6 NLRP3/NF-κB 相關蛋白含量測定 使用RIPA 裂解液提取小鼠肝組織總蛋白，離心15 min(12 000 r/min)后收集上清液，通過BCA 試劑盒定量分析各蛋白含量。通過SDS-聚丙烯酰胺電泳將各蛋白樣本移至PVDF 膜上，隨后將其放置在含量為5%脫脂牛奶中封閉2 h；完成封閉后，將膜置于相對應的一抗當中，在4 ℃環境中過夜孵育；次日進行4 次TBST 清洗，單次清洗時間為8 min，隨后放置在二抗中，在室溫條件下搖晃孵育2 h，將膜取出進行4 次清洗(TBST 清洗)，單次清洗時間為8 min，最終在凝膠成像儀中曝光并進行掃描，分析各條帶的灰度值。

2 結 果

2.1 BA 對CCl4誘導的肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響 與空白對照組比較，小鼠在被注射CCl4后，血清ALT、AST 含量顯著增加；與CCl4組相比，BA 高低劑量組小鼠血清ALT、AST 含量顯著降低，見圖1。

2.2 BA 對CCl4誘導的肝損傷小鼠血清與肝臟中細胞因子的影響 與空白對照組比較，CCl4組小鼠血清與肝臟組織中細胞因子(IL-6、IL-1β 和TNF-α)含量都出現了明顯的上升；相較于CCl4組，BA 高、低劑量組小鼠血清與肝臟組織中細胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)含量明顯下降，見圖2～3。

2.3 BA 對CCl4誘導的肝損傷小鼠肝臟組織病理改變的影響 空白對照組小鼠肝組織結構無異常，肝細胞正常；而CCl4組小鼠的肝組織切片顯示肝細胞壞死、脂肪變性，門靜脈系統炎癥反應嚴重；BA 高低劑量組則改善了CCl4導致的肝損傷小鼠的病理改變，見圖4。

2.4 BA 對CCl4誘導的肝損傷小鼠肝臟組織NLRP3/NF-κB 通路蛋白表達的影響 相較于空白對照組，CCl4組小鼠肝臟組織中NLRP3/NF-κB 通路相關蛋白(NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、p-NF-κB-p65及p-IκBα)含量明顯增加；相較于CCl4組，BA 高低劑量均能抑制小鼠肝組織中NLRP3/NF-κB 通路相關蛋白的表達，見圖5。

2.5 BA 對CCl4誘導的肝損傷小鼠肝臟組織NLRP3 免疫組化的影響 相較于空白對照組，CCl4組小鼠肝臟組織中NLRP3 蛋白含量明顯增加；相較于CCl4組，BA 高、低劑量組小鼠肝組織中NLRP3 蛋白含量明顯減少，見圖6。

3 討 論

本文采用CCl4誘導的肝損傷模型，發現BA 能顯著降低模型小鼠血清中轉氨酶(ALT、AST)的活力，能減少CCl4誘導的肝損傷細胞中IL-6、IL-1β、TNF-α 等促炎細胞因子的含量，且Western Blot 結果提示BA 可能是通過抑制NLRP3/NF-κB 信號通路起保護作用的。

ALT 和AST 為常用的肝纖維化檢測指標，二者均位于肝細胞中，當細胞膜受損或細胞變性壞死時可釋放入血，因此血清中ALT、AST 水平能很快反映出肝細胞的損傷情況。AST 分布于細胞漿和線粒體內，ALT 主要分布于細胞漿中，ALT 是肝損傷早期敏感性最強的轉氨酶，因此在診斷肝損傷中具有重要作用，其高低往往與病情輕重相平行；當出現肝損傷之后，AST 的變化幅度遠超ALT 而成為反映肝臟損傷程度的主要指標。在本研究中，小鼠血清中轉氨酶的檢測結果顯示，CCl4損傷肝細胞后AST 和ALT 的含量均增加，而BA 干預后則降低了AST 和ALT 的水平。

在造成肝損傷的各種原因之中，炎性反應具有重要的地位，減輕炎性反應可有效緩解肝損傷，因此在肝損傷的治療中，抗炎保護肝細胞至關重要[15]。當肝細胞存在實質性損傷時，因受到外界的刺激而釋放大量炎性因子，如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等，并作用于HSC、Kuffer 等細胞表面，從而誘發正向反饋調節，最終造成炎性因子的增加并加速病情的發展。IL-1β、IL-6、TNF-α 等含量在發生肝損傷后會顯著增加，并隨著病情的發展而不斷升高，說明在急性肝損傷的全程中IL-1β、IL-6、TNF-α 均有參與。在本研究中，CCl4刺激后血清和肝組織中的IL-6、IL-1β和TNF-α 均大幅度提升，而BA 能對CCl4所導致的肝組織中炎性因子的釋放能有效地抑制。

NF-κB 是Rel 蛋白家族的一員，其發揮生物學活性的主要形式是由p65/p50組成的異二聚體。在靜息狀態下，NF-κB 可與IκBα 結合形成三聚體，在細胞質中以無活性的方式存在，受到外界刺激時會對一系列蛋白激酶進行激活，如NLRP3 炎性小體等，從而誘導產生炎性反應。NLRP3 在激活炎癥因子IL-1β 和IL-18 之后，導致宿主發生炎癥反應[16-17]。NF-κB/NLRP3 通路在肝損傷過程中的炎性調節作用已明確。本研究表明，BA 能有效抑制CCl4誘導的肝損傷小鼠肝臟組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、p-NF-κB-p65 及p-IκBα 的表達。

綜上所述，本研究提示BA 可有效緩解CCl4誘導的小鼠肝損傷，且這一作用可能依賴于NF-κB/NLRP3 信號通路，其深入機制有待進一步研究。