響應面法優化紫花地丁總酚酸的提取工藝及其抗氧化活性研究

段建榮,嚴貴亮,楊 輝

(1 張家口市沙嶺子醫院藥劑科,張家口 075000;2 河北北方學院藥學系;*通訊作者,E-mail:yangkcer@163.com)

紫花地丁(Violaphilippica)為堇菜科多年生草本植物,又名野堇菜、光瓣堇菜等[1],味苦、性寒,具有清熱解毒的功效,是一種藥食同源的植物,在民間用藥歷史悠久?，F代藥理學研究表明,紫花地丁具有抗炎、抑菌、抗病毒和抗腫瘤等多種功效[2]。文獻報道紫花地丁含有豐富的有機酸類成分[3]。酚酸是有機酸中一類具有多重藥理活性的天然多酚類化合物,近年來可見較多針對植物總酚酸藥理作用的報道,發現其具有多方面的藥理活性[4-6],但目前對于紫花地丁中總酚酸的研究報道較少。

本研究采用Box-Behnken法研究紫花地丁總酚酸的提取工藝,清除DPPH自由基法測定紫花地丁總酚酸抗氧化活性,以期為紫花地丁在臨床上的應用及開發提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

紫花地丁(河北崇禮,經張家口學院韓博老師鑒定為紫花地丁Violaphilippica全草);沒食子酸對照品(天津市光復精細化工研究所);1,1-二苯基-2-苦基肼[1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl,DPPH,純度≥98%,上海賽抑生物科技有限公司];其余試劑為分析純。

1.2 儀器

Alpha-1900雙光束掃描型紫外可見分光光度計(上海譜元儀器有限公司);萬分之一電子分析天平(賽多利斯公司);PHS-3C數字酸度計(上海大普儀器有限公司);QL-901渦旋混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法與結果

2.1 紫花地丁總酚酸供試液的制備

取紫花地丁全草適量,60 ℃干燥至恒重。精密稱取干燥后的紫花地丁粗粉1 g,加入65%乙醇,液料比(ml/g)為10 ∶1,浸泡30 min,加熱回流2次,每次1 h,合并兩次提取液,過濾,取濾液,置50 ml量瓶中,加65%乙醇定容即得[7]。

2.2 對照品貯備液的制備

精密稱取沒食子酸對照品0.011 g,置100 ml棕色量瓶中,加65%乙醇溶解并定容,得沒食子酸貯備液(0.110 0 mg/ml)。

2.3 紫外吸收波長的測定

分別吸取沒食子酸對照品貯備液、紫花地丁總酚酸提取溶液各1ml,于25 ml容量瓶中,加無水乙醇4 ml,加2 ml 0.3%十二烷基磺酸鈉(SDS),加2 ml 1% FeCl3-0.5%鐵氰化鉀(1 ∶1)混合液,避光靜置5 min,加0.1 mol/ml HCl至刻度,混勻,避光反應。20 min后以66%乙醇加顯色劑為參比液進行基線校正,于波長200-800 nm處掃描[8]。結果發現在754 nm處樣品和與對照品均有最大吸收,且顯色前,兩者在該波長下無吸收,提示紫花地丁提取物溶液所含成分不會干擾總酚酸的含量測定,故確定754 nm為測定波長。

2.4 標準曲線的制備

分別取對照品貯備液0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 ml于25 ml容量瓶中,按“2.3紫外吸收波長的測定”項下方法顯色,并測定吸光度。以沒食子酸的濃度(C)為橫坐標,以吸光度(A)為縱坐標,得到標準曲線方程為:A=101.34C+0.002 1,R2=0.999 4,結果表明,沒食子酸在0-0.008 8 mg/ml范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

取對照品溶液適量,按“2.4標準曲線的制備”項下方法測定吸光度,重復測定5次,結果吸光度RSD為2.56%(n=5)。表明精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取供試品溶液適量,每隔25 min測定一次,結果吸光度RSD為3.74%(n=5)。表明樣品溶液顯色后在100 min內穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取紫花地丁粗粉6份,各1 g,按“2.1紫花地丁總酚酸的供試液的制備”項下方法制備供試品溶液,按“2.4標準曲線的制備”項下方法測定吸光度,結果吸光度RSD為2.82%(n=6)。表明重復性試驗良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的紫花地丁粗粉3份,各0.500 g,分別精密加入沒食子酸貯備液0.5 ml,按“2.1紫花地丁總酚酸的供試液的制備”項下方法制備供試品溶液,按“2.4標準曲線的制備”項下方法測定吸光度,結果平均回收率為100.81%,RSD為2.97%。

2.9 單因素實驗

分別對乙醇濃度、回流時間和液料比進行單因素實驗,確定各因素的適宜取值范圍,從而選擇響應面的設計試驗的因素水平范圍[9]。

2.9.1 乙醇濃度的考察 按2.1方法提取紫花地丁總酚酸,固定提取時間為1 h,回流提取2次,液料比(ml/g)為10 ∶1,選擇35%,45%,55%,65%,75%,85%,95%乙醇,每個濃度重復3次實驗,考察乙醇濃度對提取液吸光度的影響。圖1結果顯示,提取液平均吸光度隨乙醇濃度增加先增大后減小,當乙醇濃度為65%時,所得提取液吸光度最大[10]。

圖1 乙醇濃度對提取液吸光度的影響Figure 1 Effect of the ethanol concentration on the absorbance of exteaction solition

2.9.2 回流時間的考察 以60%乙醇為溶劑,液料比(ml/g)為10 ∶1,回流提取2次,分別選擇1 h,1.5 h,2 h,2.5 h,3 h,3.5 h作為提取時間,每個提取時間重復3次實驗,考察提取時間對提取液吸光度的影響。結果可見提取液平均吸光度隨回流時間的延長而增大,當回流時間為2 h時,所得提取液吸光度最大(見圖2)[11]。

圖2 回流時間對提取液吸光度的影響Figure 2 Effect of the reflux time on the absorbance of exteaction solition

2.9.3 液料比的考察 以濃度為65%的乙醇溶劑,液料比(ml/g)分別為10 ∶1,20 ∶1,30 ∶1,40 ∶1,50 ∶1,回流提取2次,每個液料比重復3次實驗,考察不同液料比對提取液吸光度的影響。結果可見提取液平均吸光度隨提取溶劑比例的增加先增大后減小,當液料比為30 ∶1時,所得提取液吸光度最大(見圖3)[12]。

圖3 液料比對提取液吸光度的影響Figure 3 Effect of the ratio of liquid to material on the absorbance of exteaction solition

2.9.4 提取率的計算 將測得的吸光值代入回歸方程中計算總酚酸質量濃度,再計算出總酚酸的提取率[13]?？偡铀岬寐使?R1=C×V×N/W×100%。

式中:R1表示紫花地丁總酚酸的提取率(mg/g);C表示由回歸方程計算出的樣液中總酚酸濃度(mg/ml);V表示提取液體積(ml);N表示稀釋倍數;W表示紫花地丁的質量(g)。

2.10 Box-Behnken試驗設計及響應面分析

在單因素試驗的基礎上,采用Box-Behnken設計方案,以乙醇濃度A、提取時間B、液料比C為考察因素,以紫花地丁總酚酸提取率為響應值,利用Design-Expert v8.0.6軟件優化紫花地丁總酚酸提取工藝。試驗因素、水平編碼見表1。設計方案及結果見表2,擬合二次多項式模型的方差分析見表3。

表1 實驗因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design

對表2中的數據進行多元回歸擬合,獲得紫花地丁總酚酸提取率對自變量乙醇濃度A、提取時間B、液料比C的二次多項回歸方程為:

表2 Box-Behnken試驗設計方案與結果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

R1=+0.70+0.024A+0.016B-0.020C-0.041AB+6.500×10-3AC-0.015BC-0.087A2-0.054B2-0.091C2。

由表3中的P值可以知道,方程中A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2對Y值的影響顯著,表明實驗因子對響應值不是簡單的線性關系。由回歸方程可知因素A與B,A與C及B與C均有交互作用。其回歸方程響應面及等高線見圖4-6,各交互因素的響應面存在最高點,即在所選的范圍內存在極值,說明各因素考察范圍較為適當。

圖4 乙醇濃度和提取時間對紫花地丁總酚酸提取率的響應面圖Figure 4 The contour map and response surface graph of effect of ethanol concentration and reflux time on extraction yield of total phenolic acids

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model

實驗結果表明,紫花地丁總酚酸的最佳提取工藝為:乙醇濃度66.06%,液料比33.84 ml/g,回流提取兩次,每次時間122.40 min,在此條件下預測紫花地丁總酚酸的提取率為7.04 mg/g藥材。為實驗方便,最終確定,紫花地丁總酚酸提取工藝為乙醇濃度66%,液料比34 ml/g,回流提取兩次,每次時間120 min。

圖5 液料比和乙醇濃度對紫花地丁總酚酸提取率的響應面圖Figure 5 The contour map and response surface graph of effect ratio of liquid to material and ethanol concentration on extraction yield of total phenolic acids

圖6 液料比和提取時間對紫花地丁總酚酸提取率的響應面圖Figure 6 The contour map and response surface graph of effect of ratio of liquid to material and reflux time on extraction yield of total phenolic acids

2.11 樣品的測定

精密稱取脫脂紫花地丁粗粉6份,各1 g,按照響應面法優化的提取工藝,制備提取液,顯色并測定吸光度,計算紫花地丁中總酚酸的含量?？偡铀岷糠謩e為7.05,7.01,7.03,7.06,7.02,7.03 mg/g,平均(7.033±0.014 4)mg/g,RSD=0.265%。

2.12 紫花地丁總酚酸對DPPH自由基的清除率

參照文獻[15]的方法,分別吸取適量總酚酸提取液,配制成濃度為0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/ml的待測溶液。分別吸取2 ml待測溶液,與2 ml質量濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液于試管中混勻,室溫下在暗處靜置30 min后,以維生素C為陽性對照,以無水乙醇作為參比,在517 nm處測定吸光度,用下式計算DPPH自由基抑制率(I):

I=(A0-Ae)/A0×100%。

式中:A0為不加樣品的空白吸光度,Ae為加樣品后的吸光度。

結果可知,在0.1-0.5 mg/ml的范圍內,紫花地丁總酚酸溶液的DPPH自由基清除能力與其質量濃度呈正相關,但均小于80%(見圖7)。當總酚酸溶液濃度為0.5 mg/ml時清除率為76.11%,達到最高,其對DPPH自由基的半數清除濃度IC50值為0.254 mg/ml,維生素C酸對DPPH自由基的半數清除濃度IC50值為0.077 mg/ml,說明紫花地丁總酚酸溶液在相同濃度下,對DPPH自由基的清除能力弱于維生素C。

圖7 紫花地丁總酚酸及維生素C對DPPH自由基的清除率Figure 7 DPPH free radical scavenging rate of total phenolic acids from Viola philippica and Vc

3 討論和結論

本文在單因素試驗的基礎上,將響應面法應用于優化紫花地丁活性成分總酚酸的提取。實驗結果表明,乙醇濃度、提取溫度、液料比及乙醇濃度、提取溫度、液料比平方項對紫花地丁總酚酸提取率的影響顯著,并且,各考察因素之間均有交互作用。說明乙醇濃度、提取溫度、液料比對紫花地丁總酚酸提取率的影響不是簡單的線性關系。以濃度為66%的乙醇,按照液料比34 ml/g,回流提取兩次,每次時間120 min為最佳提取工藝,在此條件下,提取的紫花地丁總酚酸的含量為7.033 mg/g,基本與預測含量相吻合。

該提取方法簡便易行,穩定可靠,重現性好,可作為紫花地丁總酚酸的提取方法,為紫花地丁作為新藥的開發及應用于臨床提供了實驗基礎。

紫花地丁總酚酸提取液對DPPH自由基的半數清除濃度IC50值為0.254 mg/ml,當濃度達到0.5 mg/ml時,對DPPH自由基的清除率接近維生素C的清除率,表明紫花地丁總酚酸提取液具有較好的抗氧化活性,可以為紫花地丁酚酸類化合物的探索研究及進一步開發利用提供理論依據,說明紫花地丁具有一定的開發價值并可能產生一定的經濟效益。