38株西藏牦牛源腸產毒性大腸桿菌ESBLs基因型檢測及耐藥性分析

王剛 趙燕娟 索朗斯珠 翟新驗

摘要：為了解38株西藏牦牛源腸產毒性大腸桿菌攜帶超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）基因亞型流行及耐藥性情況。利用藥敏試驗、PCR檢測技術對實驗室保存的38株腸產毒性大腸桿菌攜帶超廣譜β-內酰胺酶基因菌株進行耐藥性分析及耐藥基因研究。ESBLs檢測結果顯示，在初篩以及確認試驗中，有21株牦牛源腸產毒性大腸桿菌檢測為產ESBLs菌株，檢出率為55.3%?；蛐蜋z測結果表明，38株腸產毒性大腸桿菌中有34株產毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-U，檢出率為89.5%;13株產毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-1，檢出率為34.2%;4株產毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-9，檢出率為10.5%;30株產毒性大腸桿菌攜帶TEM，檢出率為78.9%;所有菌株均未檢出OXA及SHV基因型。藥敏檢測結果顯示，38株牦牛源腸產毒素大腸桿菌對萬古霉素、四環素、復方新諾明、紅霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟等均表現為高度耐藥，對頭孢噻肟的耐藥率高達100%;對氯霉素、諾氟沙星、青霉素、阿奇霉素的耐藥率分別為63.2%、50.0%、86.8%、73.7%;僅對鏈霉素、丁胺卡那、慶大霉素、頭孢唑林、頭孢西丁等表現為敏感。說明目前西藏地區產ESBLs菌株的確存在，且產ESBLs菌株的基因型以CTX型為主，TEM型次之。ESBLs的產生能明顯增加菌株的耐藥性，提示我們在臨床用藥中，不僅要合理使用抗生素，而且還要注意結合酶抑制劑的聯合應用。

關鍵詞：牦牛;大腸桿菌;超廣譜β-內酰胺酶;耐藥性;藥敏試驗

中圖分類號： S855.1+2? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0211-04

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的以下痢、全身性敗血癥為主要臨床癥狀的多種病的總稱，此病一年四季均可發生，以新生犢牛為主[1]。近年來，產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的大腸桿菌菌株呈逐年上升的趨勢，嚴重制約著臨床用藥治療大腸桿菌病的效果，使治療陷入極大困境[2]。ESBLs是β-內酰胺酶的最主要酶型，它的產生可水解包括頭孢等三代β-內酰胺類藥物，是菌株對該類藥物產生耐藥的最主要原因[3]。目前，已發現的ESBLs基因型主要有TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型等[4]。本試驗對臨床分離得到的38株腸產毒性大腸桿菌（ETEC）進行ESBLs基因型檢測，并對其耐藥性進行分析，旨在為西藏地區臨床用藥提供科學依據及理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株來源

本試驗38株牦牛源腸產毒性大腸桿菌菌株，均為西藏高原動物疫病研究自治區高校重點實驗室保存菌株，編號為1～38;質控菌為大腸埃希菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.2 主要試劑

PCR試劑、核酸染料4S Red plus等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;營養肉湯培養基、普通瓊脂培養基、麥康凱培養基及鏈霉素、頭孢唑林、青霉素、紅霉素等14種常用抗菌藥物，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器

隔水式電熱恒溫培養箱、DZF-6021型真空干燥箱，均購自北京市六一儀器廠;AB204-N型電子分析天平，購自上海醫用核子儀器廠;SW-CJ-JC超凈工作臺，購自蘇州凈化設備公司;CHA-S型往復空氣恒溫搖床，購自常州金壇良友儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗菌株的復壯

將實驗室-80 ℃保存的38株牦牛源腸產毒性大腸桿菌菌株分別接種于裝有營養肉湯培養基的三角瓶中，置于37 ℃，120 r/min 搖速的搖床中，過夜培養。

1.2.2 藥敏試驗

藥敏試驗采用美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）推薦的K-B法，其詳細操作步驟可見參照文獻[5]。抑菌結果的判定參照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）2013等公布的標準以敏感、中介、耐藥等3種形式對抑菌圈大小作出判定[6]。

1.2.3 ESBLs的檢測

根據CLSI推薦的表型篩選和確證試驗進行操作和判讀[7]。

1.2.4 ESBLs基因型檢測

從GenBank中檢索已登錄的TEM、SHV、CTX-M（CTX-M-U、CTX-M-1、CTX-M-9）、OXA（OXA-1、OXA-2、OXA-10）的基因序列，分別設計TEM、SHV、CTX-M、OXA的通用引物，然后采用Primer 5設計引物[8-9]（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系為94 ℃預變性5 min;94 ℃ 變性1 min，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，循環30 次;72 ℃延伸10 min。反應結束后，取5 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 紙片擴散法藥敏試驗結果

38株牦牛源腸產毒性大腸桿菌對14種常用抗生素的藥敏檢測結果，由表2可知，38株牦牛源腸產毒性大腸桿菌對萬古霉素、四環素、復方新諾明、紅霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、氯霉素、諾氟沙星、青霉素和阿奇霉素等均表現為耐藥，其中對四環素、頭孢噻肟耐藥率高達100.0%;所有菌株僅對丁胺卡那、慶大霉素、頭孢唑林、頭孢西丁等表現為敏感。

2.2 ESBLs檢測結果

由圖1可知，38株牦牛源腸產毒性大腸桿菌ESBLs檢測結果表明，在初篩及確認試驗中，有21株大腸桿菌檢測為產ESBLs菌株，檢出率為55.3%。其中，CFZ檢出6株，檢出率為15.8%，占總陽性株數的28.6%，CTX檢出21株，檢出率為55.3%，占總陽性株數的100%，PEN檢出18株，檢出率為47.4%，占總陽性株數的85.7%，FOX檢出3株，檢出率為7.9%，占總陽性株數的14.3%。

2.3 ESBLs基因型檢測結果

由表3可知，38株腸產毒素性大腸桿菌中有34株腸產毒性大腸桿菌攜帶 CTX-M-U，檢出率為89.5%;有13株腸產毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-1， 檢出率為34.2%;有4株腸產毒性大腸桿菌攜帶CTX-M-9，檢出率為10.5%;有30株腸產毒性大腸桿菌攜帶TEM，檢出率為78.9%;所有菌株均未檢出OXA及SHV基因型。

3 討論與結論

本試驗對38株牦牛源腸產毒性大腸桿菌進行ESBLs檢測，共檢出21株為產ESBLs菌株，陽性率為55.3%，本結果要高于Yum等報道的28.4%[10]，比苑麗等報道的76.7%低[2]。據有關報道，發現產ESBLs菌株可通過接合、轉化和轉導等方式在細菌間快速傳播耐藥基因，這給臨床治療帶來困難，更加說明了加強β-內酰胺酶監測的迫切性和必要性[11]。

ESBLs基因型檢測結果表明，目前西藏地區產ESBLs牦牛源大腸桿菌流行的基因型主要以TEM型和CTX-M型為主，尚未檢測出SHV型。ESBLs基因型與菌株的耐藥表型相關，TEM的產生可使菌株對PEN耐藥，而CTX-M的產生對CTX水解效率更高，耐藥率也隨之增高[2，12]，本次藥敏試驗結果顯示所有菌株對青霉素、頭孢噻肟的耐藥率分別為868%、100.0%，產ESBLs菌株中TEM及CTX-M-U的檢出率分別為78.9%、89.5%，這一檢出率高于謝苗苗報道的檢出率[13]，同時可以看到本試驗中藥敏試驗結果與耐藥基因檢出率基本一致，這與TEM主要介導PEN耐藥、CTX-M介導CTX耐藥觀點相一致。本次ESBLs基因型檢測結果同時也顯示，產CTX-M型ESBLs菌株耐藥率高于產TEM型ESBLs菌株，并且對其他種類藥物的耐藥率也高于TEM型ESBLs菌株，這提示臨床中對CTX-M型耐藥菌株的治療將更加艱難，須引起我們高度警惕。

通過本藥敏試驗結果可知，21株產酶菌對三代頭孢類抗生素的耐藥率為10.5%～100.0%，并非都是100.0%，即仍存在著部分菌株對此類藥物表現出體外敏感，但產ESBLs菌株通常表現為體外敏感而體內耐藥的特點[14]，因此只用體外藥敏試驗結果的方法來指導臨床用藥是不全面的。鑒于牦牛源大腸桿菌產酶檢出率較高，因此建議在臨床中應用藥敏試驗檢測的同時，也要進行ESBLs的檢測，一旦檢測到陽性菌株，則不管藥敏試驗結果如何都應視為分離株對第三代頭孢藥物耐藥[15]。本研究中藥敏試驗結果還顯示，產ESBLs菌株對除β-內酰胺類藥物以外的其他抗菌藥物也同時存在較高的耐藥率，即在交叉耐藥和多重耐藥現象上表現的要比非產酶菌株嚴重的多，至于什么原因導致該現象的產生尚須通過后續研究其耐藥機制來進行闡述。

參考文獻：

[1]龐書琴. 犢牛大腸桿菌病的防治[J]. 中國畜牧獸醫文摘，2018，34（1）：190-191.

[2]苑 麗，劉建華，胡功政，等. 30株雞大腸桿菌ESBLs基因型檢測及耐藥性分析[J]. 中國預防獸醫學報，2009，31（6）：438-443.

[3]王 鵬. 腸桿菌科細菌中超廣譜β-內酰胺酶和外膜蛋白的研究[D]. 上海：復旦大學，2012.

[4]沈莉萍，徐 鋒，張維誼，等. 1997—2010年上海市豬源大腸桿菌耐藥性和產ESBLs菌的基因型檢測[J]. 中國動物檢疫，2017，34（9）：26-30，45.

[5]索朗斯珠，王 剛，羅潤波，等. 西藏牦牛源大腸桿菌主要耐藥表型及耐藥基因檢測[J]. 中國獸醫學報，2017，37（8）：1501-1506.

[6]貢 嘎，王 剛，拉 珍，等. 西藏牦牛大腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥性分析[J]. 中國獸醫雜志，2014，50（8）：80-82.

[7]付秀玲，吳 華，陳紅英，等. 禽致病菌ESBLs和AmpC酶的檢測及藥敏分析[J]. 華中農業大學學報，2007，26（2）：217-222.

[8]張青嫻，徐引弟，王治方，等. 河南省豬源大腸桿菌ESBLs基因型檢測及耐藥性分析[J]. 山西農業科學，2018，46（12）：2087-2093.

[9]魏 丹. 肺炎克雷伯菌臨床分離株的耐藥性及產ESBLs的基因型分析[D]. 鄭州：鄭州大學，2015.

[10]Yum J H，Kim S，Lee H，et al. Emergence and wide dissemination of CTX-M-type ESBLs，and CMY-2- and DHA-1-type AmpC β-lactamases in Korean respiratory isolates of Klebsiella pneumoniae[J]. Journal of Korean Medical Science，2005，20（6）：961-965.

[11]孫 紅. 肺炎克雷伯菌ESBLs檢測和KPC酶分析[D]. 合肥：安徽醫科大學，2011.

[12]Palzkill T.Structural and mechanistic basis for extended-spectrum drug-resistance mutations in altering the specificity of TEM，CTX-M，and KPC β-lactamases[J]. Frontiers in Molecular Biosciences，2018，5：16.

[13]謝苗苗. 畜禽肉源大腸桿菌CTX-M型ESBLs的流行狀況及傳播機制研究[D]. 南京：南京農業大學，2016.

[14]高莉莉，劉章平. 產ESBLs大腸埃希菌和克雷伯菌的耐藥性分析[J]. 延安大學學報（醫學科學版），2008，6（4）：9，11.

[15]陳天寶，陳建魁，于 農，等. 同時產ESBLs和AmpC酶菌株的表型檢測及其意義[J]. 中國誤診學雜志，2008，8（24）：5802-5803.

收稿日期：2019-08-31

基金項目：國家肉牛牦牛產業體系項目（編號：CARS-37）;元亨基金項目（編號：603318017）。

作者簡介：王 剛（1988—），男，河南信陽人，碩士，助教，主要從事高原動物傳染病研究。E-mail：1039376778@qq.com。

通信作者：索朗斯珠，博士，教授，主要從事高原動物疫病防控研究。E-mail：xzslsz@163.com。