復合纖維素酶菌劑降解禽畜糞便動力學過程研究

成福 王萬能

摘要：在自然堆肥過程中，禽畜糞便熟化是一個溫度不斷變化的過程，當堆肥溫度低于或高于微生物菌群的最適溫度時，微生物產酶效率低下甚至不產酶，導致禽畜糞便堆肥過程中纖維素的降解效率較低，費時較長。研究開發了一種復合菌劑，發酵菌劑按體積比1.5∶1.5∶1∶1∶1∶1取里氏木霉、假單孢菌、近平滑假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、煙曲霉、嗜熱液化芽孢桿菌的培養液共30L，混合成復合菌劑，并將其應用于堆肥降解禽畜糞便纖維素。復合菌劑中各菌種的最適產酶溫度與堆肥發酵不同階段溫度相對應，可以在堆肥過程中不同發酵溫度階段都能持續產酶，促進禽畜糞便中纖維素的分解。添加菌劑后可提前提高禽畜糞便發酵堆肥纖維素酶活性的水平及其峰值，縮短堆肥發酵時間，對堆肥的適應性及腐熟效果好。

關鍵詞：禽畜糞便;堆肥;復合菌劑;纖維素酶

中圖分類號：S-3文獻標識碼：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200815004

收稿日期：2020-07-03

基金項目：蘇北科技發展計劃—科技富民強縣項目（項目編號：BN2015010）

作者簡介：成福（1999-），男，碩士在讀。研究方向：微生物與生化藥學;通訊作者王萬能（1971-），男，博士，教授。研究方向：生物代謝調控。

由于集約化禽畜生產迅速發展，禽畜糞便的產生量急劇增加，對環境造成了嚴重威脅[1]。2001年，全國禽畜糞便年排放量已高達18.84億t，并且還在持續增加，是工業廢棄物年排放量的約3.4倍。畜禽糞便中含有大量的有機物，其中纖維素含量較多[2]。禽畜糞便的隨意排放會污染土壤、地下水以及對植物生長產生影響，甚至引起植物死亡[3]。目前，纖維素的處理方法主要有物理法、化學法和生物法。物理法耗能高，化學法在濃酸濃堿處理后，帶來新的環境問題。而生物法利用微生物產生的纖維素酶進行降解，具有反應條件溫和，高效無化學污染的特性[4]，適合禽畜糞便的處理。目前，市場上已有的多種商業纖維素酶，大部分都是由木霉屬和曲霉屬菌株生產得到的[5]。自然堆肥禽畜糞便的熟化速度慢，并且不易起溫，達不到我國堆肥無害化處理標準，添加商業纖維素酶的又使得成本較高，不利于大規模處理。若能在堆肥過程中利用纖維素降解菌降解纖維素，不但可以促進堆肥的熟化進程，而且能提高堆肥的質量。但是在自然堆肥過程中，禽畜糞便熟化過程是一個溫度不斷變化的過程，當堆肥溫度低于或高于微生物菌群的最適溫度時，微生物產酶效率低下甚至不產酶，導致禽畜糞便堆肥過程中纖維素的降解效率較低、費時較長。如，北方地區冬季溫度偏低，很多微生物的活動受到抑制，不能充分發揮作用。篩選低溫產纖維素酶菌可以在低溫條件下高效反應提高纖維素的降解率[6]。所以需要尋找具有特殊活性的產酶菌株，耐低溫、高溫纖維素酶等。利用各菌種的協同作用來高效快速地降解纖維素，選取一些功能菌株進行組合獲得混合菌種的復合菌劑，提高禽畜糞便中纖維素的轉化效率[7]。

因此，針對現有技術不足，研究開發了一種復合菌劑，由最適低溫產酶菌、最適常溫產酶菌、最適高溫產酶菌組成，使得菌劑各菌種的最適產酶溫度與堆肥發酵不同階段溫度相對應，兩者的變化曲線相擬合匹配，各菌種協同生長，形成較為穩定的產纖維素酶環境，在堆肥過程不同發酵溫度階段都能持續產酶，促進禽畜糞便中纖維素的分解，為高效降解禽畜糞便中的纖維素，提高其使用和轉化效率有重要意義。

1材料與方法

1.1材料與試劑

養殖場禽畜糞便，其有機質含量79%，碳氮比（C/N）16，含水量65%，pH值7.21;稻殼粉。

菌種：里氏木霉（Trichoderma reesei），購自北京中科質檢生物技術有限公司;假單胞菌（Pseudomonadaceae）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 10441;近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 1257;枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subspecies）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 10832;煙曲霉（Aspergillus funigatus）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 2434;嗜熱液化芽胞桿菌（Bacillus thermoliquefaciens）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC 20647。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、瓊脂 15～20g、蒸餾水1000mL，pH 7.4～7.6。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato Dextrose Agar Medium）：馬鈴薯200g、葡萄糖 20g、瓊脂 15～20g、蒸餾水1000mL，pH自然。

氫氧化鈉：成都市科隆化學品有限公司;酒石酸鉀鈉：成都市科隆化學品有限公司;苯酚：成都市科隆化學品有限公司;亞硫酸鈉：成都市科隆化學品有限公司;重鉻酸鉀：成都市科隆化學品有限公司。

1.2儀器與設備

生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠;ZHWY-2102c恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司;高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司;pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司;紫外分光光度計：上海儀電儀器分析有限公司;自動壓力蒸汽滅菌鍋：廈門致微儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1復合菌劑制備

復合菌劑細菌菌種由最適低溫產酶菌、最適常溫產酶菌、最適高溫產酶菌組成。最適低溫產酶菌為假單孢菌，最適常溫產酶菌為枯草芽孢桿菌枯草亞種，最適高溫產酶菌為嗜熱液化芽孢桿菌。復合菌劑真菌菌種由最適低溫產酶菌、最適常溫產酶菌、最適高溫產酶菌組成，其中，最適低溫產酶菌為里氏木霉，最適常溫產酶菌為近平滑假絲酵母菌，最適高溫產酶菌為煙曲霉。取里氏木霉、假單孢菌、近平滑假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、煙曲霉、嗜熱液化芽孢桿菌，其中，假單孢菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、嗜熱液化芽孢桿菌分別在牛肉膏蛋白胨培養基中液體培養60～72h，至活菌數均達到108個·mL-1，培養溫度為28℃;里氏木霉、近平滑假絲酵母菌、煙曲霉分別在PDA培養基中培養96h，至有效活菌數均達到104CFU·g-1左右，培養溫度為26℃。按體積比1.5∶1.5∶1∶1∶1∶1取調節好濃度的里氏木霉、假單孢菌、近平滑假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種、煙曲霉、嗜熱液化芽孢桿菌的培養液，共計30L，混合成復合菌劑，備用。

1.3.2堆肥發酵

取養殖場禽畜糞便600kg，測定其有機質含量為79%，碳氮比（C/N）為16，含水量為65%，pH值為7.21。將禽畜糞便用30kg稻殼粉調節禽畜糞便水分含量至50%～55%，堆在2m×1m×0.5m的發酵箱體中。取復合菌劑添加進發酵箱體禽畜糞便中，攪拌均勻，并覆蓋薄膜保溫。堆肥過程中，采用乙醇溫度計測定堆溫，記錄堆肥溫度變化。對照組取相同重量的禽畜糞便并經同樣處理后堆在2m×1m×0.5m的發酵箱體中。對照組按體積比1∶1取近平滑假絲酵母菌和枯草芽孢桿菌枯草亞種培養液，共計30L，添加進發酵箱體中，攪拌均勻，并覆蓋薄膜保溫。

1.3.3堆肥中有機質含量及碳氮比（C/N）檢測

堆肥過程中，每天取樣檢測分析堆肥物質變化情況，樣品為多點混合樣。采用K2Cr2O7容量法測定各混合樣的有機質含量[8]。采用國家農業標準NY525-2011測定各混合樣中C/N含量[9]，并采用3.5-二硝基水楊酸顯色法測定各混合樣中纖維素酶活性[10]。

2結果與分析

2.1堆肥過程中溫度變化

堆肥溫度是從表觀上判定堆肥腐熟程度的重要指標，溫度通過影響微生物活性和有機物降解速率控制發酵進程。加入菌劑處理之后，試驗組在堆肥過程中逐漸產生有腐熟的氣味，到13d堆肥質地變疏松，堆肥由黑色變為黑褐色，表明此時熟化完成。而對照組在堆肥發酵過程中腐熟氣味的產生稍晚于試驗組，而且到第18天時堆肥質地才變疏松，堆肥由黑色變為黑褐色，完成熟化時間較試驗組晚。在整個堆肥過程中，試驗組同對照組一樣，堆肥溫度隨時間的變化呈先上升后下降的變化曲線。菌劑中各菌種的最適產酶溫度與堆肥發酵不同階段溫度相對應，兩者的變化曲線相擬合匹配，各菌種協同生長，形成較為穩定的產纖維素酶環境，在堆肥過程不同發酵溫度階段都能持續產酶，促進禽畜糞便中纖維素的分解。試驗組在堆肥發酵3d后，達到最高溫度63℃，維持3d后，溫度逐漸下降，如圖1。對照組在6d達到最高溫度56℃，較試驗組堆肥3d就達到最高溫度63℃還是有不少的差距，充分表明復合菌劑的作用加快了反應的進程。試驗組與對照組相比，試驗組堆肥升溫早、升溫快，堆肥中加入復合微生物菌劑可提高溫度峰值，且高溫持續時間較長，腐熟效果更好，試驗組堆肥降解速率加快，纖維素降解效率提高，加快了堆肥發酵速度，縮短了堆肥發酵時間。

2.2堆肥纖維素酶活性變化

酶活性直接影響堆肥的腐熟進程和發酵的強度，畜禽糞便中含有大量難以降解的纖維素，通過對堆肥中纖維素酶活性的測定，可以了解堆肥中纖維素降解的情況。試驗加入復合菌劑進行堆肥后，記錄第1天初始溫度。堆肥前期，堆肥溫度隨時間的變化而不斷升高至最高溫度63℃，堆肥中的纖維素酶活性隨之升高，至發酵結束，纖維素酶活性保持在1.3～1.6U·g-1較高水平。至高溫63℃之后，直至熟化完成堆肥中的纖維素酶下降趨勢小，最后維持在1.2U·g-1的水平。而對照組堆肥中的纖維素酶活性在6d后才達到最高1.2U·g-1，表明加入復合菌劑后，可以提高纖維素酶的活力，加快反應的進行。由于試驗組提前提高禽畜糞便發酵堆肥纖維素酶活性的水平及峰值，禽畜糞便發酵堆肥中纖維素酶活性峰值比傳統發酵菌劑堆肥方法提前5d，且纖維素酶活性一直維持在較高水平，表明復合菌劑中各菌種積極發揮作用，協同提高纖維素的降解效率，纖維素酶活力隨時間的變化曲線如圖2。

2.3堆肥有機質含量及C/N變化

堆肥發酵進行熟化，取樣測定發現試驗組堆肥在15d后有機質含量為386.3g·kg-1，堆肥熟化完畢后有機質含量降至61%。對照組堆肥在15d有機質含量為436.8g·kg-1，堆肥熟化完畢后有機質含量降至67%。由堆肥中有機質的變化量可知，試驗組與對照組相比，試驗組對禽畜糞便中有機質的降解效果更好，實驗組的有機質含量下降幅度較對照組更大，表明該復合菌劑可有效促進禽畜糞便中有機質的降解。C/N也是評價禽畜糞便發酵熟化度的常用方法之一，試驗組堆肥C/N值熟化完畢后，測定C/N結果顯示為12.6，對照組堆肥熟化完畢后C/N為14.8，表明該復合菌劑可加快堆肥熟化的進程，提高禽畜糞便熟化度。

3結論

由于本試驗復合菌劑中的最適高、常、低溫產酶菌具有協同關系，組成的最適產酶溫度與堆肥發酵不同階段溫度相對應，兩者的變化曲線相擬合匹配，各菌種協同生長，堆肥發酵過程中，各溫度階段都有最適的產纖維素微生物菌種大量繁殖，持續產生纖維素酶，使復合菌劑在不同發酵溫度階段都能持續產酶，形成穩定的產纖維素酶微環境，酶活力較為穩定，可有效促進堆肥過程中纖維素的降解，可加快堆肥熟化的進程，提高禽畜糞便熟化度，而且對堆肥的適應性及腐熟效果都要強于傳統發酵菌劑堆肥。采用復合菌劑處理禽畜糞便，與傳統發酵菌劑堆肥相比，該復合菌劑可以提前提高禽畜糞便發酵堆肥纖維素酶活性的水平及峰值，比傳統發酵菌劑堆肥提前2～3d出現，且纖維素酶活性一直持續在較高水平，利于降解禽畜糞便中的纖維素，有助于推進農業廢棄物資源化利用，在開辟新的環境治理和能源開發思路具有重要的理論和實踐意義，特別是對環境保護和可持續發展將會起到決定性的作用。

參考文獻

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（責任編輯周康）