巴西橡膠樹小孢子單細胞顯微分離研究

楊星星 王英 莊南生 高和瓊 王宇翔

摘? 要：巴西橡膠樹是一種重要的熱帶作物。以巴西橡膠樹‘熱研7-33-97處于減數分裂四分體時期的幼嫩雄花為試驗材料來獲取單細胞，利用5%纖維素酶、5%果膠酶、5% β-葡聚糖酶、5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶4種酶液，探索酶解四分體胼胝質的最佳方案。結果表明：在37 ℃條件下酶解1 h，5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶的酶解效果最佳，可得到品質良好的小孢子單細胞。通過對拉制針尖細長度、磨針斜口直徑以及顯微操作分離體系的不斷探索與試驗，成功建立一套適合巴西橡膠樹‘熱研7-33-97小孢子單細胞的顯微分離技術體系。小孢子單細胞是減數分裂的直接產物，對小孢子單細胞進行分離并分析可精確解析橡膠樹減數分裂過程中基因的重組與交換，確定橡膠樹基因組的變異情況。該研究結果將為橡膠樹單細胞全基因組測序提供理論與技術支持。

關鍵詞：巴西橡膠樹;顯微分離;單細胞;四分體

中圖分類號：Q943? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： Hevea brasiliensis is an important tropical crop. In this study， the young male flowers of ‘Reyan 7-33-97 in the meiotic tetrad period were used as the experimental materials to obtain single cells. Four enzymatic solutions， 5% cellulose， 5% pectinase， 5% β-glucanase， 5% cellulase and 4% pectinase mixed enzyme solution， were used in the experiment to explore the best scheme for the degradation of tetrad callose. As a result， under the condition of 1 h and 37 ℃， 5% cellulase and 4% pectinase mixed enzyme solution had the best enzymatic hydrolysis effect， and the single microspore with good quality could be obtained. Through the continuous exploration and experiment on the fine length of the needle tip， the diameter of the sharpening of the needle and the micro-operation separation system， a set of microdissection technology system suitable for the single microspore of ‘Reyan 7-33-97 was successfully established. Single-microspores were the direct products of meiosis. The separation and analysis of single cells could accurately resolve gene recombination and exchange during the meiosis of rubber trees， and determine the genomic variation. The study would provide theoretical and technical support for single-cell whole genome sequencing of H. brasiliensis.

Keywords： Hevea brasiliensis; microdissection; single cell; tetrad

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.003

顯微操作分離技術是利用倒置顯微鏡、顯微操作器，結合電動機械控制的毛細玻璃針進行分離單個細胞或者單染色體的技術[1-2]，操作具有靈活取樣、目標明確、操作簡單、成本低等優點，是一種較常用的分離技術。據統計，自顯微分離技術建立以來，就因其優勢在動物遺傳學[3-5]、醫學[6-7]、微生物學[8-10]等諸多領域得到廣泛應用。然而，由于植物細胞的特異性，這項技術在植物中的應用受到限制，技術進展緩慢。隨著植物細胞遺傳學的發展及研究者在技術上的不斷追求與創新，植物顯微操作分離技術被日益完善，也相繼實現了植物染色體[10-11]、體細胞[12-13]等的分離。在植物中的單細胞分離技術是實現植物單細胞水平研究的基礎[14]，可為構建SNP細胞遺傳圖譜、植物分子育種等研究提供技術基礎。近年來，在測序時，研究者采用的樣品多是細胞群體或是大量細胞的混合DNA，這樣獲得的全基因組序列信息，僅是多數占優勢的細胞所表達的某些明顯的序列信息，而忽視了少數細胞表達的差異性[15-18]。世界上不可能存在2個完全相同的細胞，單個細胞間的表達調控同樣存在差異[19]，為了獲得細胞異質性表達的微量序列信息，單細胞全基因組測序應運而生。目前，關于植物單細胞的分離研究已有少量報道，如2015年李響[20]利用顯微分離技術成功分離出玉米小孢子單細胞，解析了玉米減數分裂重組機制，構建了玉米SNP圖譜;Kubo等[21]利用顯微分離技術成功分離出小立碗蘚葉片的單細胞，建立了單細胞數字基因表達，完成單細胞測序。

2.3? 4種酶液對巴西橡膠樹雄花四分體胼胝質的酶解效果

小孢子母細胞發育到減數分裂后期，胼胝質包裹著四分體。試驗發現若要得到小孢子單細胞，通過物理手段難以實現。本研究對4種酶液在不同溫度及時間條件下的巴西橡膠樹雄花四分體胼胝質的酶解效果進行探索，結果見表3和圖3。從表3可見，同種酶液在相同的酶解時間內，溫度對四分體胼胝質的酶解情況影響不大。圖3展示的是37 ℃條件下4種酶液在不同時間內對四分體胼胝質的酶解情況。綜合分析表3和圖3可知，（1）酶解1 h時，5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶完全酶解四分體胼胝質，釋放出小孢子單細胞，酶解率為100%（圖3A），其余3種酶液均未釋放出小孢子單細胞;其中，5%纖維素酶開始酶解四分體外圍胼胝質，酶解率約為65%～75%（圖3B），而5%果膠酶、5%β-葡聚糖酶均未酶解胼胝質，酶解率為0（圖3C、D）。（2）酶解3 h時，5%纖維素酶基本酶解四分體外圍胼胝質，酶解率約為88%～90%;5%果膠酶開始起作用，出現釋放小孢子單細胞現象，酶解率約為25%～ 32%;5% β-葡聚糖酶未酶解胼胝質，酶解率為0（圖3E～G）。（3）酶解6 h時，5%纖維素酶完全酶解掉外圍胼胝質，酶解率達到95%～98%，但四分體的4個小孢子單細胞仍然相連;5%果膠酶酶解釋放出多個小孢子單細胞，但仍有胼胝質殘留，酶解率約80%～85%;5% β-葡聚糖酶的酶解率僅有20%～25%，可使胼胝質層變薄，但不能釋放出小孢子單細胞（圖3H～J）。研究結果表明：在37 ℃條件下，采用5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶，酶解時間為1 h時是酶解巴西橡膠樹雄花四分體胼胝質的最佳方案。在適宜溫度內，橡膠樹四分體胼胝質的酶解效果與酶液種類與酶解時間有關，其酶解效率見表3。

2.4? 巴西橡膠樹小孢子單細胞的顯微分離技術體系

借助已建立的巴西橡膠樹‘熱研7-33-97單個四分體的顯微分離技術體系，分離出單個四分體，利用酶解四分體釋放出的4個小孢子單細胞，建立適合于分離巴西橡膠樹‘熱研7-33-97小孢子單細胞的顯微分離技術體系。具體體系如下：（1）37 ℃條件下，采用5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶酶解1 h，釋放出4個小孢子單細胞;步驟（2）～（8）參照已建立的巴西橡膠樹‘熱研7-33-97單個四分體的顯微分離技術體系（1）～（7），其中步驟（3）因為分離材料的不同，略有改動，磨出的斜口直徑調整為30～40 μm;（9）重復步驟（6）～（8），直至將4個小孢子單細胞全部轉移于含有10 μL 27%山梨醇緩沖液的PCR管內，4 ℃冰箱中保存。利用該技術體系，先后成功分離出582個小孢子單細胞，成功率約為90%，其中完整的來自同一個四分體的4個單細胞的成功率為70%～80%。巴西橡膠樹‘熱研7-33-97小孢子單細胞的顯微分離過程如圖4所示。

3? 討論

本研究發現在制備巴西橡膠樹雄花的四分體標本時，未經染色的巴西橡膠樹雄花在相差顯微鏡下無法觀察到四分體細胞，所以需要在制備四分體懸液前對雄花進行染色。改卡寶品紅主要應用于減數分裂、染色體染色，具有染色效果好、時間短、染色穩定等優點，是很好的細胞染色劑[30]，故采用改卡寶品紅染色液對橡膠樹雄花進行染色處理。在制備標本過程中，為了盡量避免外源污染，對試驗中所用試劑、載玻片、鑷子等試驗器具進行嚴格的滅菌處理，整個制備過程在超凈工作臺中進行。在標本制備中，筆者發現初制備的細胞懸液在一定程度上含有花藥壁等雜質，因此我們利用移液器對其進行簡單的細胞稀釋與挑選，有利于后期利用顯微分離獲得干凈、無雜質的橡膠樹單個四分體。

胼胝質是一種以β-1，3鍵結合形成的線性葡聚糖[31-32]，廣泛存在于高等植物的細胞壁中[33]，在植物的篩管代謝、配子體發育等生命活動中具有重要的調節作用，其合成與分解可直接影響植物正常的生長代謝過程。四分體是花粉母細胞經減數分裂后形成的產物，花粉母細胞減數分裂前期開始形成胼胝質，在早四分體時期達到最厚，形成雄配子體前胼胝質未解體[34]。本研究為了得到來源于同一四分體的4個小孢子單細胞，筆者利用顯微分離得到的單個四分體，對其進行酶解因素的探索，結果發現在37 ℃條件下酶解1 h，利用5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶降解四分體胼胝質的效果最佳，這與高和瓊等[27]在制備橡膠樹染色體標本時所達到的試驗結果類似。同時，本研究還發現5%纖維素酶和5%果膠酶也具備酶解胼胝質作用，但2種酶液的酶解方式有所不同，纖維素酶從四分體外部逐漸溶解胼胝質，但不具備釋放4個單細胞的作用，5%果膠酶則直接作用于小孢子單細胞所在部位的胼胝質，逐一釋放小孢子單細胞，雖可達到試驗目的，但所需時間過長，建議不采用，纖維素酶與果膠酶酶解四分體胼胝質的方式與鄧秀新等[35]報道的酶解柑桔四分體原生質體的方式相同。

本研究利用顯微操作技術分離單個四分體和小孢子單細胞。在操作前使用乙醇脫脂棉對拉針儀、磨針儀以及倒置顯微鏡等儀器設備進行酒精消毒，試驗所用試劑、工具等進行嚴格滅菌處理，盡量減少在試驗過程中可能產生的外源污染，這與王發明等[36]、殷卉等[37]在顯微分離植物單染色體試驗中減少污染的方法相同。為了建立一套適合分離橡膠樹單個四分體和小孢子單細胞的顯微分離技術體系，筆者對試驗體系進行了嚴格的分析與摸索。筆者發現，拉針時，拉針儀的熱值越高，針尖越長，口徑越細，為保證針尖部位的細長，設置80 ℃高溫，以避免毛細玻璃針在磨取針尖部位后，管壁口徑太大，影響視野;分離單個四分體時，因四分體直徑大小約60 μm，毛細玻璃針磨取的斜口直徑需>60 μm，分離小孢子單細胞時，考慮到小孢子單細胞直徑大小過小約30 μm，因此在磨制玻璃針時，調整斜口直徑為30～40 μm;利用5%纖維素酶與4%果膠酶混合酶獲得的小孢子單細胞，為避免有酶液殘留，在分離過程中需要多次更換27%山梨醇緩沖液的液體環境，反復進行吸取與吹打，保證最終分離保存的小孢子單細胞無酶液殘留。通過總結顯微分離經驗，筆者發現分離單個四分體的成功率可達100%，但分離小孢子單細胞的成功率約為90%，其中來自同一個四分體的4個單細胞的成功率僅為70%～80%。分析出現這種情況的原因：一方面是小孢子單細胞過小，在分離過程中會丟失;另一方面是操作者的分離技術。因此，操作者應熟練掌握分離技術，提高操作水平，是保證試驗成功的基礎。

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